Summary

Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Published: November 04, 2018
doi:

Summary

ICP0 subit une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. On ne connaît pas le mécanisme moléculaire de cet événement. Nous décrivons ici l’utilisation du microscope confocal comme un outil permettant de quantifier le mouvement ICP0 dans l’infection HSV-1, qui jette les bases pour l’analyse quantitative ICP0 translocation dans de futures études mécanistes.

Abstract

Cellule infectée protéine 0 (ICP0) de l’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) est une protéine début immédiate contenant une anneau de type E3 ubiquitine ligase. Il est responsable de la dégradation de proteasome des facteurs restrictifs de l’hôte et l’activation des gènes viraux ultérieures. ICP0 contient une séquence de localisation nucléaire canonique (NLS). Il pénètre dans le noyau immédiatement après la synthèse de novo et exécute ses fonctions de défense de l’hôte contre principalement dans le noyau. Cependant, plus tard dans l’infection, ICP0 se trouve exclusivement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. Sans doute ICP0 translocation permet ICP0 de moduler ses fonctions selon ses emplacements sous-cellulaires lors des phases d’infection différents. Afin de délimiter la fonction biologique et le mécanisme de régulation de la translocation nucléaire-à-cytoplasmique ICP0, nous avons modifié une méthode de microscopie par immunofluorescence pour surveiller ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1. Ce protocole consiste immunofluorescence, microscope confocal imagerie nucléaire vs distribution cytoplasmique analyse et. Le but du présent protocole est d’adapter les images confocales état stationnaire, pris dans une évolution temporelle dans une documentation quantitative du mouvement ICP0 tout au long de l’infection lytique. Nous proposons que cette méthode peut être généralisée pour analyser quantitativement nucléaire vs localisation cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires sans faire appel à une technologie d’imagerie live.

Introduction

L’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) provoque un large éventail de légère à sévères maladies herpétiques, y compris l’herpès labial, l’herpès génital, kératite stromale et l’encéphalite. Une fois infecté, le virus crée une vie latente dans les neurones des ganglions. Parfois, le virus peut être réactivé par différentes raisons telles que la fièvre, le stress et immunodépression1, conduisant à l’infection par l’herpès récurrent. Protéine de la cellule infectée 0 (ICP0) est un important régulateur viral crucial pour les lytique et latente infection HSV-1. Il transactive virus en aval gènes via contrecarrer l’hôte des défenses antivirales intrinsèque/innée2,3. ICP0 a une activité de ligase E3 ubiquitine, qui s’adresse à plusieurs facteurs cellulaires pour la dégradation du protéasome dépendante3. Il interagit aussi avec les diverses voies de cellule de réglementer leurs activités et par la suite pour compenser l’hôte antiviral restrictions3. ICP0 est connu pour localiser à différents compartiments subcellulaires à mesure que l’infection progresse3,4,5. La protéine a un signal de localisation nucléaire riche en lysine/arginine (NLS) situé à résidus 500 à 5066. Lors de la synthèse de novo au début infection HSV-1, ICP0 est immédiatement importées dans le noyau. Il est tout d’abord détecté à une dynamique nucléaire structure appelé domaine nucléaire 10 (ND10)7. L’activité de ligase E3 ubiquitine de ICP0 déclenche la dégradation des protéines organisateur ND10, protéine (PML) la leucémie promyélocytaire et protéine moucheté 100 kDa (Sp100)8,9,10. Après la perte de protéines de l’organisateur, ND10 corps nucléaires sont dispersées et ICP0 est diffusée pour remplir le noyau entier4,11.

Fait intéressant, après le début de la réplication de l’ADN viral, ICP0 disparaît du noyau. On le trouve uniquement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique fin de HSV-1 infection4,12. L’exigence de la réplication de l’ADN implique l’implication potentielle d’un fin ou des protéines virales dans la facilitation de la translocation cytoplasmique de HSV-1 ICP04,12. Apparemment ICP0 traite entre les différents compartiments au cours de l’infection confère le pouvoir ICP0 de moduler ses interactions à diverses voies cellulaires de façon spatio-temporelle et donc coordonner ses multiples fonctions à fine tune l’équilibre entre lytique et latente HSV-1 infection13. Pour mieux comprendre ICP0 multifonctionnalité et la coordination des domaines fonctionnels ICP0 tout au long de l’infection lytique, nous avons soigneusement disséqué la base moléculaire de la dynamique de la translocation de ICP012. Pour mener les études mécanistiques rapportées antérieurement12, nous avons appliqué une méthode de coloration par immunofluorescence pour visualiser la localisation sous-cellulaire ICP0 au statut de différentes infections sous microscope confocal. Nous avons également développé un protocole quantitatif pour analyser la nucléaire vs cytoplasmique distribution de ICP0 en utilisant le logiciel confocal. La population de cellules infectés par HSV-1 a été tabulée pendant les phases de l’infection et les tendances du mouvement ICP0 ont été analysés, sous différents traitements biochimiques12. Nous décrivons ici le protocole détaillé que la translocation de documents ICP0 dans l’infection par HSV-1. Nous proposons que cette méthode puisse être adoptée comme une méthode générale pour étudier la translocation nucléaire vs cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires, qui peut servir d’alternative aux direct imaging lorsque la technique d’imagerie live est inapplicable en raison de problèmes tels que l’étiquetage méthode, intensité du signal ou l’abondance de la protéine.

Protocol

1. cellule ensemencement et infection par le Virus 20 – 24 h avant l’infection par le virus, des graines de 5 x 104 cellules fibroblastes pulmonaires embryonnaires humaines (HEL) ou d’autres cellules pour être examiné sur une lame de 4 puits 11 mm décalées dans le milieu de croissance (de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % fœtale bovine sérum (FBS)). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2).NOTE : Chaque bien doit avoir confluen…

Representative Results

Pour comprendre les bases moléculaires et les fonctions biologiques de la ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1, nous utilisons une méthode de microscopie par immunofluorescence pour analyser ICP0 distribution subcellulaire lors des phases d’infection différents. La figure 1 montre les cellules représentant avec distinctif ICP0 localisation en cours de l’infection. Afin de quantifier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de ICP0, nous…

Discussion

Ce protocole a été utilisé pour étudier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de HSV-1 ICP0. ICP0 subit le trafic sous-cellulaire au cours de l’infection par HSV-1 (Figure 1). Sans doute, ICP0 interagit avec différentes voies cellulaires à des fonctions différentes à différents endroits. Cette mesure ICP0 affiner ses multiples fonctions dans le bras de fer avec l’hôte humain13. Cependant, comment ICP0 coordonne les multiples fonctions d’une mani…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions financièrement par une subvention du NIH (RO1AI118992) attribuée à Gu Haidong. Nous remercions l’installation de microscopie, d’imagerie et cytométrie en ressources (MICR) Core à la Wayne State University pour le support technique.

Materials

Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10X) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

Riferimenti

  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

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Citazione di questo articolo
Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

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