Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi
Summary
ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.
Abstract
Enfekte hücre protein herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) 0 (ICP0), bir halka tipi E3 Ubikuitin ligaz içeren acil bir erken proteindir. Ana bilgisayar kısıtlayıcı faktörler ve sonraki viral gen harekete geçirmek proteasomal bozulması için sorumludur. ICP0 bir kanonik nükleer yerelleştirme sıra (NLS) içerir. Hemen de novo sentezi sonra çekirdek girer ve anti-konak savunma fonksiyonları çekirdeğinde esas olarak yürütür. Ancak, daha sonra enfeksiyon, sitoplazma içinde yalnızca, HSV-1 enfeksiyonu sırasında bir nükleer-için-sitoplazmik translocation geçtiği öne ICP0 bulunur. Muhtemelen ICP0 translocation fonksiyonları hücre altı onun konumları göre farklı enfeksiyon aşamaları modüle ICP0 sağlar. Biyolojik işlev ve ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation düzenleyici mekanizma betimlemek için ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında kaçakçılığı izlemek için bir immünfloresan mikroskopi yöntemi değiştirildi. Bu iletişim kuralı immünfloresan boyama, confocal mikroskop düşsel ve nükleer vs. sitoplazmik dağıtım analiz içerir. Bu iletişim kuralı bir saat ders boyunca litik enfeksiyon ICP0 hareketinin niceliksel bir dokümantasyon içine çekilen kararlı duruma confocal görüntüler adapte hedeftir. Önerdiğimiz bu yöntem canlı görüntüleme teknolojisi içeren olmadan nükleer vs diğer viral veya hücresel proteinler sitoplazmik yerelleştirilmesini kantitatif analiz etmek için genelleştirilmiş.
Introduction
Herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) hafif ağır herpetik hastalığa herpes labialis, genital herpes, stromal keratit ve ensefalit gibi geniş bir dizi neden olur. Enfekte sonra Virüs sinir gangliyon hücreleri bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Zaman zaman, virüs gibi ateş, stres ve bağışıklık suppression1tekrarlayan herpes enfeksiyonu için önde gelen, çeşitli nedenlerle tarafından etkinleştirilebilir. Enfekte hücre proteindir 0 (ICP0) bir anahtar viral regülatörü litik ve gizli HSV-1 enfeksiyonu için çok önemli. Ana bilgisayar içsel/doğuştan gelen antiviral savunma2,3mücadele aşağı akım virüs genleri ile transactivates. ICP0 proteasome bağlı bozulma3için çeşitli hücre faktörler hedefleyen bir E3 Ubikuitin ligaz etkinlik vardır. Ayrıca çeşitli hücre yolları faaliyetlerini düzenleyen ve daha sonra ana bilgisayar antiviral kısıtlamaları3dengelemek için etkileşim kurar. ICP03,4,5enfeksiyon devam ederken farklı hücre altı bölmeleri bulmak için bilinir. Protein artıkları 500-5066‘ bulunan bir lisin/arginin-zengin nükleer yerelleştirme Uyarısı (NLS) vardır. Erken HSV-1 enfeksiyonu, de novo sentezi ICP0 hemen çekirdek alınır. Bu ilk yapısı olarak adlandırılan nükleer etki alanı 10 (ND10) bir dinamik nükleer tespit7. ICP0 E3 Ubikuitin ligaz etkinliği ND10 düzenleyici proteinler, promyelötik lösemi (PML) protein ve benekli protein 100 kDa (Sp100)8,9,10bozulması tetikler. Organizatör protein kaybı sonra ND10 nükleer ceset dağınık ve ICP0 tüm çekirdek4,11doldurmak için yayılmış.
İlginçtir, viral DNA ikileşmesi başlangıcı sonra ICP0 çekirdek kaybolur. Bu sadece bir nükleer-için-sitoplazmik translocation HSV-1 enfeksiyonu4,12içinde geçtiği öne sitoplazmada bulunur. DNA ikileşmesi şartı HSV-1 ICP04,12sitoplazmik translocation kolaylaştıran bir geç viral protein(s) potansiyel katılımı anlamına gelir. Görünüşe göre ICP0 farklı bölmeler arasında enfeksiyon sırasında kaçakçılığı ICP0 onun etkileşimlerine uzamsal-zamansal bir biçimde çeşitli hücresel yolları modüle güçlendirir ve bu nedenle koordinat ince ayar yapmak için birden fazla işlevleri arasındaki dengeyi ayarlama litik gizli HSV-1 enfeksiyonu ve13. ICP0 Çokişlevlilik ve ICP0 işlevsel etki alanları boyunca litik enfeksiyon koordinasyonu daha iyi anlamak için dikkatli bir şekilde dinamik ICP0 translocation12moleküler temeli kesmiştim. Mekanik çalışmaları daha önce bildirilen12yapmak için farklı enfeksiyon durumu confocal mikroskop altında ICP0 hücre altı yerelleştirme görselleştirmek için immünfloresan boyama yöntemi uyguladım. Ayrıca confocal yazılımını kullanarak nükleer vs. sitoplazmik dağıtımını ICP0 analiz için nicel bir protokol geliştirdik. HSV-1 enfekte hücreleri nüfusu enfeksiyon aşamaları sekmeli ve farklı biyokimyasal tedavilerin12altında ICP0 hareketinin eğilimleri analiz edildi. Burada detaylı iletişim kuralı bu belgeleri ICP0 translocation HSV-1 enfeksiyonu içinde açıklayın. Önerdiğimiz bu yöntem nükleer vs. sitoplazmik translocation canlı görüntüleme tekniği nedeniyle uygulanamaz olduğunu ne zaman canlı görüntüleme alternatif olarak hizmet verebilir diğer viral veya hücresel proteinler için eğitim için genel bir yöntem olarak kabul edilmesi yöntemi, sinyal şiddeti veya protein bereket etiketleme gibi sorunları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı HSV-1 ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation çalışma kullanılmaya başlanmıştır. ICP0 hücre altı HSV-1 enfeksiyonu (Şekil 1) sırasında kaçakçılığı uğrar. Büyük olasılıkla, ICP0 farklı yerlerde farklı işlevleri gerçekleştirmek için çeşitli hücre yolları ile etkileşim kurar. Bu ICP0 birden çok fonksiyonları halat çekme insan konak13ile ince ayar sağlar. Ancak, ne kadar ICP0 birden fazla işlevi uzamsal-za…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mali desteği Haidong Gu için layık bir NIH hibe (RO1AI118992) teşekkür ederim. Wayne State Üniversitesi’nde mikroskobu, görüntüleme ve sitometresi kaynakları (MICR) çekirdek tesis teknik destek için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
Riferimenti
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
- Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
- Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
- Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
- Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
- Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
- Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
- Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
- Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
- Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
- Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
- Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
- Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
