免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1蛋白核细胞质转移的时间分析
Summary
icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间经历核细胞质转移。这个事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了共聚焦显微镜作为量化1型单纯疱疹病毒感染 icp0 运动的工具, 为定量分析 icp0 在未来的机械研究中的移位奠定了基础。
Abstract
单纯疱疹病毒 1 (hsv-1) 的感染细胞蛋白 0 (icp0) 是一种直接的早期蛋白, 含有 rg-3 泛素连接酶。它负责宿主限制性因子的蛋白酶体降解和随后的病毒基因激活。icp0 包含一个规范的核本地化序列 (nls)。它在新合成后立即进入原子核, 并主要在原子核中执行其抗主机防御功能。然而, 在感染后期, icp0 仅在细胞质中发现, 这表明在1型单纯疱疹病毒感染期间发生了核细胞质间的移位。据推测, icp0 的移位使 icp0 能够根据其在不同感染阶段的亚细胞位置调节其功能。为了描述 icp0 核细胞质迁移的生物学功能和调控机制, 我们改进了免疫荧光显微镜法, 以监测 icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间的贩运情况。该协议包括免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像和核与细胞质分布分析。该协议的目标是将在时间过程中拍摄的稳态共聚焦图像调整为整个裂解感染过程中 icp0 运动的定量文档。我们提出, 该方法可以推广到定量分析核与细胞质定位的其他病毒或细胞蛋白, 而不涉及实时成像技术。
Introduction
单纯疱疹病毒 1 (hsv-1) 可引起多种轻度至重度疱疹疾病, 包括唇部疱疹、生殖器疱疹、间质角膜炎和脑炎。一旦感染, 该病毒建立在神经节神经元的终身潜伏性感染。有时, 病毒可以通过各种原因重新激活, 如发烧、压力和免疫抑制1, 导致复发性疱疹感染。感染细胞蛋白 0 (icp0) 是对裂解和潜伏性1型单纯疱疹病毒感染至关重要的关键病毒调节剂。它通过抵消宿主固有的抗病毒防御 2,3,使下游病毒基因转化.icp0 具有 e3 泛素连接酶活性, 针对几个细胞因子进行蛋白酶依赖性降解3。它还与各种细胞通路相互作用, 以调节其活动, 并随后抵消宿主抗病毒限制3。据悉, icp0 位于不同的亚细胞隔间, 因为感染进行 3,4,5。该蛋白质具有富含赖氨酸的核定位信号 (nls), 位于500至 506–6 残留物处。在早期 hsv-1 感染的早期重新合成后, icp0 立即被输入细胞核。它首先被探测到在一个称为核域 10 (nd10)7的动态核结构。icp0 的 e3 泛素连接酶活性触发 nd10 组织者蛋白、早幼粒细胞白血病 (pml) 蛋白和斑点蛋白 100 kda (sp100)8、9、10的降解。在源蛋白丢失后, nd10 核体被分散, icp0 被分散填充整个核 4,11。
有趣的是, 病毒 dna 复制开始后, icp0 从细胞核中消失。它仅存在于细胞质中, 表明在 hsv-1 感染后期发生了核-细胞质转移的4,12。dna 复制的要求意味着一种晚期病毒蛋白可能参与促进1型 hsv-1 icp04,12的细胞质移位。显然, icp0 在感染期间在不同隔间之间的贩运使 icp0 能够以时空的方式调节其与各种细胞通路的相互作用, 从而协调其多重功能, 以微调裂解和潜伏性1型 hsv-1感染13。为了更好地理解 icp0 的多功能和 icp0 功能域在整个裂解感染过程中的协调, 我们仔细地剖析了动态 icp0 移位12的分子基础。为了进行先前报道的12个机械研究, 我们应用免疫荧光染色方法, 在共聚焦显微镜下观察 icp0 亚细胞在不同感染状态下的定位。我们还开发了一个定量协议, 利用共聚焦软件分析 icp0 的核与细胞质分布。在不同的生化处理12下, 对感染 hsv-1 型 hsv 病毒的细胞在整个感染阶段进行了列表,并分析了 icp0 运动的趋势。在这里, 我们描述了记录 icp0 在1型单纯疱疹病毒感染中的易位的详细协议。我们建议将这种方法作为研究其他病毒或细胞蛋白的核与细胞质移位的一般方法, 当活体成像技术不适用时, 可以作为活体成像的替代方法:标记方法、信号强度或蛋白质丰度等问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议已被用于研究1型 hsv-1 icp0 的核细胞质迁移。icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间遭到亚细胞贩运 (图 1)。很可能, icp0 与各种细胞通路相互作用, 在不同的位置执行不同的功能。这使得 icp0 能够在与人类主机13的拔河比赛中微调其多重功能。然而, icp0 如何以时空的方式协调多个函数还没有得到很好的研究。利用上述荧光显微镜协议, 我们开始分析 icp0 核细?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢国家卫生研究院授予海东谷的赠款 (ro1ai111892) 的财政支持。我们感谢韦恩州立大学的显微镜、成像和细胞仪 (micr) 核心设施提供的技术支持。
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
Riferimenti
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