Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Virus del herpes simple 1 (HSV-1) causa una amplia gama de leves a graves enfermedades herpéticas incluyendo herpes labial, herpes genital, encefalitis y queratitis stromal. Una vez infectado, el virus establece una infección latente de por vida en las neuronas de los ganglios. Ocasionalmente, el virus puede reactivarse por varios motivos como la fiebre, el estrés y la supresión inmune¹, conduce a la infección por herpes recurrente. Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) es un regulador viral clave crucial para lítica y latente la infección HSV-1. Transactivates virus aguas abajo genes por medio de contrarrestar el host intrínseca/innata defensas antivirales^2,3. ICP0 tiene una actividad de ligasa de ubiquitina E3, que apunta a varios factores celulares de degradación proteasome-dependiente³. También interactúa con diversas vías de células para regular sus actividades y posteriormente compensar host antiviral restricciones³. ICP0 se sabe ubicar en diferentes compartimentos subcelulares como la infección procede de^3,4,5. La proteína tiene una señal de arginina/lisina-ricos de localización nuclear (NLS) en residuos 500 a 506⁶. Sobre la síntesis de novo en la infección temprana por HSV-1, ICP0 se importa inmediatamente en el núcleo. Primero se detecta en una dinámica nuclear estructura denominado dominio nuclear 10 (ND10)⁷. La actividad de ligasa de ubiquitina E3 de ICP0 provoca la degradación de proteínas de organizador ND10, proteína de promyelocytic leucemia (PML) y proteína moteado 100 kDa (Sp100)^8,9,10. Después de la pérdida de proteínas del organizador, ND10 cuerpos nucleares están dispersas y ICP0 se difunde para llenar el núcleo entero^4,11.

Curiosamente, después del inicio de la replicación del DNA viral, ICP0 desaparece el núcleo. Únicamente se encuentra en el citoplasma, lo que sugiere la ocurrencia de un desplazamiento nuclear-a-citoplásmico en la infección de HSV-1^4,12. El requisito de la replicación del DNA implica la posible participación de una proteína viral finales para facilitar la translocación citoplásmica de HSV-1 ICP0^4,12. Al parecer ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante la infección permite a ICP0 para modular sus interacciones a diversas vías celulares de una manera espacial y temporal, y por lo tanto coordinar sus múltiples funciones para ajustar el equilibrio entre la lítica y latente HSV-1 infección¹³. Para entender mejor ICP0 multifuncionalidad y la coordinación de dominios funcionales ICP0 durante la infección lítica, diseccionamos cuidadosamente la base molecular de la dinámica de desplazamiento ICP0¹². Para llevar a cabo el estudio de mecanismos previamente divulgados¹², hemos aplicado un método de tinción inmunofluorescente para visualizar ICP0 localización subcelular en el estado de infección diferentes bajo el microscopio confocal. También hemos desarrollado un protocolo cuantitativo para analizar la nuclear vs citoplásmico distribución de ICP0 utilizando el software confocal. La población de células infectadas por HSV-1 se tabularon en las fases de la infección y se analizaron las tendencias de movimiento ICP0, bajo diferentes tratamientos bioquímicos¹². Aquí describimos el protocolo detallado desplazamiento de documentos ICP0 en infección por HSV-1. Proponemos que este método puede ser adoptado como un método general para el estudio de la translocación citoplásmico nuclear vs otras proteínas virales o celulares, que puede servir como alternativa al vivo la proyección de imagen cuando la técnica de imagen vivo es inaplicable debido a problemas tales como etiquetado método, intensidad de la señal o abundancia de la proteína.