Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente
Summary
ICP0 subisce la traslocazione nucleare–citoplasmico durante l’infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l’uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell’infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.
Abstract
Cellula infettata proteine 0 (ICP0) del virus herpes simplex 1 (HSV-1) sono una proteina di inizio immediata contenente un’anello-tipo E3 ubiquitina ligasi. È responsabile della degradazione proteasomica di fattori restrittivi ospite e l’attivazione successiva gene virale. ICP0 contiene una sequenza canonica localizzazione nucleare (NLS). Entra nel nucleo immediatamente dopo la sintesi de novo ed esegue le sue funzioni di difesa anti-ospite principalmente nel nucleo. Tuttavia, più tardi nell’infezione, ICP0 si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare–citoplasmico durante l’infezione HSV-1. Presumibilmente ICP0 traslocazione consente ICP0 di modulare le sue funzioni secondo sue sedi subcellulari alle fasi di infezione diversa. Al fine di delineare la funzione biologica e il meccanismo di regolazione della traslocazione nucleare–citoplasmico ICP0, abbiamo modificato un metodo di microscopia immunofluorescente per monitorare il traffico di ICP0 durante l’infezione HSV-1. Questo protocollo coinvolge macchiatura immunofluorescente, microscopio confocale imaging e nucleare vs citoplasmico analisi di distribuzione. L’obiettivo del presente protocollo è quello di adattare le immagini confocal di stato stazionario prese a un corso di tempo in una documentazione quantitativa del movimento ICP0 in tutta l’infezione litica. Proponiamo che questo metodo può essere generalizzato per analizzare quantitativamente nucleare vs localizzazione citoplasmatica di altre proteine virali o cellulare senza coinvolgere la tecnologia di imaging dal vivo.
Introduction
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) provoca una vasta gamma di lievi a gravi malattie erpetiche compreso herpes labiale, herpes genitale, cheratite stromal ed encefalite. Una volta infettato, il virus stabilisce un’infezione latente permanente in neuroni dei gangli. In alcuni casi, il virus può essere riattivato da vari motivi quali febbre, stress e soppressione immune1, conducente all’infezione di herpes ricorrente. Proteina della cellula infettata 0 (ICP0) è un regolatore chiave di virale cruciale per l’infezione HSV-1 sia litica e latente. Esso transattiva a valle virus geni tramite contrastando l’host difese antivirale intrinseca/innate2,3. ICP0 è un’attività della ligasi di ubiquitin E3, che si rivolge ai diversi fattori di cella per degradazione proteasoma-dipendente3. Esso interagisce anche con varie vie di cella per regolare le loro attività e successivamente per compensare host antivirale restrizioni3. ICP0 è noto per individuare in diversi compartimenti subcellulari come procede l’infezione3,4,5. La proteina ha un segnale di arginina/lisina-ricco di localizzazione nucleare (NLS) situato a residui 500 a 5066. Al momento di sintesi de novo a inizio infezione da HSV-1, ICP0 viene immediatamente importato nel nucleo. In primo luogo viene rilevato in una dinamica nucleare struttura definito dominio nucleare 10 (ND10)7. L’attività di ligasi di ubiquitin E3 di ICP0 innesca la degradazione delle proteine organizzatore ND10, proteina promyelocytic di leucemia (PML) e proteina maculato 100 kDa (Sp100)8,9,10. Dopo la perdita di proteine organizzatore, ND10 corpi nucleari sono dispersi e ICP0 è diffusa per riempire l’intero nucleo4,11.
È interessante notare che, dopo l’inizio della replicazione del DNA virale, ICP0 scompare dal nucleo. Si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare–citoplasmico tardi in HSV-1 infezione4,12. Il requisito della replica del DNA implica la partecipazione potenziale di una proteina virale tardivo nel facilitare la traslocazione citoplasmica di HSV-1 ICP04,12. Apparentemente ICP0 traffico tra diversi comparti durante infezione autorizza ICP0 per modulare le interazioni di varie vie cellulari in modo spaziale e temporale, e quindi coordinare le sue multiple funzioni alla fine tune l’equilibrio tra litiche e latente HSV-1 infezione13. Per capire meglio ICP0 multifunzionalità e il coordinamento di ICP0 domini funzionali durante l’infezione litica, abbiamo dissecato accuratamente la base molecolare della dinamica ICP0 traslocazione12. Per condurre gli studi meccanicistici precedentemente segnalati12, abbiamo applicato un metodo di macchiatura immunofluorescente per visualizzare la localizzazione sottocellulare ICP0 presso lo stato di infezione diversa sotto il microscopio confocale. Abbiamo anche sviluppato un protocollo quantitativo per analizzare il nucleare vs citoplasmico distribuzione di ICP0 utilizzando il software confocale. La popolazione delle cellule di infezione da HSV-1 è stata tabulata in tutte le fasi di infezione e sono state analizzate le tendenze del movimento ICP0, sotto diversi trattamenti biochimici12. Qui descriviamo il protocollo dettagliato quello spostamento di documenti ICP0 nell’infezione di HSV-1. Proponiamo che questo metodo può essere adottato come metodo generale per studiare la traslocazione nucleare vs citoplasmatica per altre proteine virali o cellulare, che può servire come alternativa al live imaging quando la tecnica di imaging dal vivo è inapplicabile a causa problemi quali etichettatura metodo, intensità del segnale o abbondanza di proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato usato per studiare la traslocazione nucleare–citoplasmico di HSV-1 ICP0. ICP0 subisce subcellulare traffico durante l’infezione di HSV-1 (Figura 1). Probabilmente, ICP0 interagisce con varie vie di cellule per svolgere funzioni diverse in luoghi diversi. In questo modo ICP0 a mettere a punto le sue multiple funzioni nel braccio di ferro con ospite umano13. Tuttavia, come ICP0 coordina le funzioni multiple in modo spaziale e temporale non è…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il sostegno finanziario da una sovvenzione di NIH (RO1AI118992) assegnata a Haidong Gu. Ringraziamo la struttura microscopia, Imaging & Core Cytometry risorse (MICR) presso la Wayne State University per il supporto tecnico.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
Riferimenti
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