ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.
Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) des Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) ist ein sofortiger Anfang Protein mit einem RING-Typ E3-Ubiquitin-Ligase. Es ist verantwortlich für den proteasomalen Abbau von Host einschränkende Faktoren und die anschließende virale Genaktivierung. ICP0 enthält eine kanonische nuklearen Lokalisierung Abfolge (NLS). Es tritt den Kern sofort nach de-Novo -Synthese und führt seine Anti-Host Verteidigungsfunktionen vor allem im Zellkern. Jedoch später in Infektion, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion ICP0 ausschließlich im Zytoplasma, gefunden. Vermutlich kann ICP0 Translokation ICP0 seine Funktionen entsprechend seine subzellulären Standorten in verschiedenen Infektion Phasen zu modulieren. Um die biologische Funktion und Regulationsmechanismus ICP0 Atom-cytoplasmatische Translokation abzugrenzen, haben wir eine immunofluorescent Mikroskopie-Methode zur Überwachung der ICP0 Menschenhandel bei HSV-1 Infektion geändert. Dieses Protokoll beinhaltet immunofluorescent Färbung, confocal Mikroskop Bildgebung und nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilungsanalyse. Das Ziel dieses Protokolls ist die Steady-State konfokale Bilder in einen zeitlichen Verlauf in eine quantitative Dokumentation der ICP0 Bewegung in der lytischen Infektion anzupassen. Wir schlagen vor, dass diese Methode verallgemeinert werden kann, um nuklearen vs. zytoplasmatischen Lokalisierung von anderen viralen oder zelluläre Proteine quantitativ zu analysieren, ohne Einbeziehung von live-imaging-Technologie.
Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) verursacht eine Vielzahl von leichten bis schweren herpetische Erkrankungen einschließlich Herpes Labialis, Herpes genitalis, stromale Keratitis und Enzephalitis. Einmal infiziert, stellt das Virus eine lebenslange latente Infektion in den Ganglien Neuronen. Gelegentlich kann das Virus durch verschiedene Ursachen wie Fieber, Stress und Immunsuppression1, führt zu immer wiederkehrenden Herpes-Infektion reaktiviert werden. Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) ist viral Schlüsselregulator für lytische und latente HSV-1 Infektion von entscheidender Bedeutung. Es transactivates nachgeschalteten Virus Gene über Bekämpfung der Host intrinsische/angeborenen antiviralen Abwehr2,3. ICP0 hat eine E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit, die mehrere Zelle Faktoren für Proteasom-abhängige Abbau3richtet sich an. Es interagiert auch mit verschiedenen Zelle Signalwege, ihre Aktivitäten zu regulieren und anschließend Rechner antiviralen Einschränkungen3auszugleichen. ICP0 tritt bekanntermaßen bei verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu finden, da die Infektion3,4,5 verläuft. Das Protein besitzt ein Arginin/Lysin-reiche nuklearen Lokalisierung-Signal (NLS) Rückstände 500, 506-6. Bei der de-Novo -Synthese im frühen HSV-1 Infektion wird ICP0 sofort in den Zellkern importiert. Es ist zuerst erkannt, bei einer dynamischen nukleare Struktur bezeichnet Nuklearbereich 10 (ND10)7. Die E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit der ICP0 löst den Abbau von ND10 Veranstalter Proteine, Promyelocytic Leukämie (PML) Protein und gesprenkelten Protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Nach dem Verlust von Proteinen, Veranstalter ND10 nuklearen Einrichtungen sind weit verstreut und ICP0 wird verbreitet, um die gesamte Kern4,11zu füllen.
Interessant ist, nach dem Einsetzen der viralen DNA-Replikation verschwindet ICP0 aus dem Zellkern. Es findet ausschließlich im Zytoplasma, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation spät in HSV-1 Infektion4,12. Das Erfordernis der DNA-Replikation bedeutet die mögliche Beteiligung von einem späten virale benutzt bei der Erleichterung der zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP04,12. Offenbar ICP0 Handel unter verschiedenen Kompartimenten während der Infektion befähigt ICP0 seine Interaktionen zu verschiedenen zellulären Wege in eine räumlich-zeitliche Mode zu modulieren, und daher koordinieren ihre vielfältigen Funktionen zu feinen Melodie die Balance zwischen die lytische und latente HSV-1 Infektion13. Zum besseren Verständnis der ICP0 Multifunktionalität und die Koordination der ICP0 Funktionsbereiche in der lytischen Infektion seziert wir sorgfältig die molekulare Grundlagen der dynamischen ICP0 Translokation12. Um die mechanistische Studien bereits berichtet12durchführen zu können, haben wir eine immunofluorescent Färbung Methode um ICP0 subzelluläre Lokalisation bei verschiedenen Infektionsstatus unter confocal Mikroskop visualisieren angewendet. Wir haben auch eine quantitative Protokoll zu analysieren, die nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilung der ICP0 mit Hilfe der konfokalen Software entwickelt. Die Bevölkerung von HSV-1 infiziert Zellen war während der gesamten Infektion tabellarisch dargestellt und die Trends der ICP0 Bewegung wurden unter verschiedenen biochemischen Behandlungen12analysiert. Hier beschreiben wir dem ausführliche Protokoll, dass Dokumente ICP0 Translokation in HSV-1-Infektion. Wir schlagen vor, daß diese Methode kann, als eine allgemeine Methode angenommen werden, um die nukleare vs. zytoplasmatischen Translokation für andere virale oder zelluläre Proteine, studieren die dienen können, als Alternative zur live Bildgebung, wenn die live bildgebende Verfahren ist nicht anwendbar auf Probleme wie Kennzeichnung Methode, Signalintensität oder Protein Fülle.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nukleare zu zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP0 zu studieren. ICP0 erfährt subzelluläre Menschenhandel bei HSV-1 Infektion (Abbildung 1). Wahrscheinlich, ICP0 interagiert mit verschiedenen Zelle Signalwege, verschiedene Funktionen an unterschiedlichen Standorten durchzuführen. Dies ermöglicht ICP0 zur Feinabstimmung ihre vielfältigen Funktionen in das Tauziehen mit menschlichen Gastgeber13. Aber ist wie ICP0 die…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken finanziellen Unterstützung aus einem NIH-Zuschuss (RO1AI118992) an Haidong Gu vergeben. Wir danken der Mikroskopie, Imaging & Zytometrie Ressourcen (MICR) Core-Anlage an der Wayne State University für den technischen Support.
Cells and viruses | |||
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
Medium | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
Reagents | |||
4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
Horse Serum | Sigma | H1270 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
Nail Polish | Sally Hansen | ||
Equipment | |||
Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
Excel software | Microsoft Excel | ||
HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |