Summary

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Published: May 05, 2017
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Summary

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Abstract

Es gibt viele gut entwickelte Methoden zur Reinigung und einzelne Proteine ​​und Peptide zu studieren. Allerdings sind die meisten zellulären Funktionen von Netzwerken interagierender Proteinkomplexen durchgeführt, die oft schwierig zu untersuchen, da ihre Bindung nicht-kovalent und leicht durch Reinigungstechniken gestört. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung und Trenn native Protein-Komplexe aus nicht-veränderten Geweben zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von. Tissue-Lysat wird auf eine nicht-denaturierenden blau-native Polyacrylamidgel geladen, dann wird ein elektrischer Strom angelegt wird, bis das Protein, das eine kurze Strecke in das Gel wandert. Die Gelstreifen die migrierten Protein enthält, wird dann mit den aminreaktiven Vernetzungsreagenz Dithiobis (succinimidylpropionat), das kovalent Protein ausgeschnitten und inkubiert Komplexe stabilisiert. Die Gelstreifen vernetzten Komplexe enthalten, werden dann ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel eingegossen, und tEr komplexe sind vollständig getrennt. Die Methode beruht auf Techniken und Materialien, die den meisten Molekularbiologen vertraut sind, was bedeutet, dass es kostengünstig und leicht zu erlernen ist. Während es in seiner Fähigkeit, äußerst große Komplexe adäquat zu trennen, begrenzt ist und nicht allgemein erfolgreich war, war die Methode in der Lage, eine Vielzahl von gut untersuchten Komplexen zu erfassen und ist wahrscheinlich auf viele interessierende Systeme anwendbar.

Introduction

Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein – Wechselwirkungen 1, 2. Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe 3 markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chromatographie 4. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, muss für jedes Zielprotein verändert werden, und führen oft zu geringen Ausbeuten. Moderne Reinigungsverfahren umfassen die Fusion von Peptid – Tags an Zielproteine, durch Immunpräzipitation oder Extraktion auf Säulen , gefolgt mit Perlen zu einem Einfang – Moleküle gebunden 5 geladen wird ,„> 6. Während dieses erweiterbaren viele Proteine ist, erfordert es Sequenzmodifikation des Ziels, möglicherweise in Konstrukten führt , die für ihre üblichen Bindungspartner in der Affinität unterscheiden. Die empfindliche Natur einiger Protein-Protein – Wechselwirkungen , bedeutet dieses Verfahren nicht anwendbar sein kann viele Szenarien. Außerdem ist das Pull-down-Assays verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen abbilden kann keine genaue zelluläre Bild erfassen, aufgrund eingeschränkter Freiheitsgrade und nicht-nativen Mengen des Köders Proteins.

Idealerweise Proteinkomplexe könnten zur Reinigung oder Pull-Down ohne die Notwendigkeit, in ihren Heimatstaat nachgewiesen werden. Blau nativen Polyacrylamid – Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde als weniger denaturierende Alternative zu Natriumdodecylsulfat – Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) entwickelt und erlaubt die Trennung von einigen Proteinen und Komplexen aus biologischen Proben 7. Eine getrennte Proteine ​​in BN-PAGE auf Basis eines LARge Anzahl von Variablen, einschließlich der Größe, Ladung, dreidimensionale Struktur, und die Assoziation mit anderen Molekülen. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren führen häufig in Zusammenarbeit Trennung von Proteinen, die Aggregatbildung und schlechter Proteinbande Auflösung. Zweidimensionale nativer Polyacrylamid – Gelelektrophorese löst einige, aber nicht alle dieser Probleme 8.

Um die Komplikationen zu umgehen mit nativer Trennung verbunden sind , verwenden einige Autoren aminreaktive Vernetzungsreagenzien, wie Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), Proteinkomplexe in Gewebelysaten 4 zu erfassen. Diese behandelten Lysate können dann durch SDS-PAGE denaturiert und abgetrennt werden, während die native Größe und Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. Da jedoch die Vernetzungsreagenzien auf die Nähe von einem Molekül zum anderen auf Basis reagieren und Proteine ​​in Gewebe-Lysaten haben viele Freiheitsgrade und kann stochastisch interagieren, nicht-spezifischen Hintergrund Quer-Verknüpfung kann in konzentrierten Proben hoch, vor allem sein. Dies kann schwierig zu interpretierenden Ergebnissen führen zu.

Hier stellen wir die Verwendung eines Hybrid-BN-PAGE / SDS-PAGE-Verfahren zeigen, bezeichnet als Multimer-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Multimer-PAGE), zu trennen, und das Protein Baugruppen in komplexen Mischungen zu erfassen. Anfänglich wird Zelllysat in Polyacrylamidgel über BN-PAGE suspendiert. Das Lysat enthaltende Gel wird dann mit dem Vernetzungsreagenz DSP. Pseudo-immobilisierte und leicht auf dem Gel aufgetrennt, Proteine ​​sind viel weniger wahrscheinlich unspezifisch zu reagieren, was bedeutet, Hintergrund Vernetzers Reaktivität verringert wird. Nach der Vernetzung werden die Gel-Banden ausgeschnitten und mittels SDS-PAGE getrennt. Das resultierende Gel kann dann durch ein beliebiges Mittel typischerweise mit Polyacrylamidgelelektrophorese assoziiert analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung und den Nachweis von nativen Proteinkomplexen in unmodifizierter Gewebelysat, ohne die Notwendigkeit für eine zusätzliche Reinigung oder Pull-Down.

Protocol

1. Gewebepräparation Herstellung von 10 ml der 4-fach BN-PAGE-Probenpuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v Glycerin, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). HINWEIS: Diese Stammlösung im Voraus und bei 4 ° C durchgeführt werden kann. Verdünnte 250 ul 4x Probenpuffer in 750 & mgr; l dH 2 O , enthaltend 1x kommerziellen Protease – Inhibitor – Cocktail. Vortex und Chill auf Eis. Homogenisiert 20 mg des Zielgewebe…

Representative Results

In dieser Demonstration Experiment wurde Multimer-PAGE auf ganzem Rattenhirn-Lysat durchgeführt. Die resultierenden getrennten Proteine ​​wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen geblottet und dann mit Antikörpern gegen Proteine ​​untersucht, die Komplexe sind dafür bekannt, zu bilden. Abbildung 1 zeigt eine Validierung des Protokolls durch zwei Mittel. Erstens, zeigen wir , dass die vernetzten Proteine durch Zugabe eines Reduktionsmittels abspaltbar…

Discussion

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für jede Aufgabe Lebewesen auszuführen. Aus diesem Grunde sind sie Gegenstand intensiver Prüfung und Forschung. Multimer-PAGE ist ein neues Verfahren für die Erfassung, trennt, und eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu analysieren. Wir haben bereits gezeigt , seine Anwendbarkeit oligimerization des krankheitsassoziierten Protein α-Synuclein 11 bis zu studieren. Jedoch ist es dehnbar zu vielen Proteinkomplexen, wie in Abbildung 2

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unterstützt durch die NIH / NIDA DA034783. Wir danken Bryan A. Killinger für technische Unterstützung bei der Multimer-PAGE.

Materials

Chemicals
ε-Aminocaproic acid Sigma A2504
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) BioRad 161-0148 Toxic.
Ammonium persulfate Sigma A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit Thermofisher 23225
Bis-tris Sigma B9754
Bovine serum albumin Sigma A9647
Butanol Fisher Scientific A399-1
Chemiluminescence substrate kit ThermoFisher 24078
Coomassie blue G-250 Sigma-Aldrich B0770
Digitonin Sigma D141 Toxic.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate) Thermo Scientific 22585
Dry nonfat milk LabScientific M0841
Glycerol Sigma G9012
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail Thermofisher 78430
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144SI-212 For titration. Caustic.
Methanol Fisher Scientific A412-4 For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Sigma T9281
N,N'-methylenebisacrylamide Acros Organics 16479 Toxic.
NP40 Boston Bioproducts P-872
Polysorbate 20 (tween-20) Fisher Scientific BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes Thermo Scientific 88518
Ponceau S Sigma P3504
Potassium chloride Fisher Scientific P217-3
Potassium phosphate monobasic Sigma P9791
Protease inhibitor cocktail Thermo Scientific 88265
SDS solution (10% w/v) BioRad 161-0416
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium dodecyl sulfate Sigma L37771
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-1
Tricine Sigma T0377
Tris base Fisher Scientific BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) BioRad 161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) BioRad 161-0798
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000 GE Healthcare 28-9558-10
ImageJ software NIH
Synergy H1 microplate reader BioTek
Gel Former + Stand Biorad
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer Fisher Scientific FB120220

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples. J. Vis. Exp. (123), e55341, doi:10.3791/55341 (2017).

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