Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques
Summary
Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.
Abstract
Il existe de nombreuses méthodes bien développées pour purifier et étudier des protéines et des peptides uniques. Cependant, la plupart des fonctions cellulaires sont réalisées par des réseaux de complexes de protéines qui interagissent, qui sont souvent difficiles à étudier car leur liaison n'est pas covalente et facilement perturbée par des techniques de purification. Ce travail décrit une méthode de stabilisation et de séparation des complexes de protéines indigènes à partir de tissus non modifiés en utilisant une électrophorèse en gel de polyacrylamide bidimensionnelle. Le lysat de tissu est chargé sur un gel de polyacrylamide natif non dénaturant, puis on applique un courant électrique jusqu'à ce que la protéine migre à une courte distance dans le gel. La bande de gel contenant la protéine migrée est ensuite excisée et incubée avec le réactif réticulant réactif à l'aminé dithiobis (propionate de succinimidyle), qui stabilise de manière covalente les complexes de protéines. La bande de gel contenant des complexes réticulés est ensuite jetée dans un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium et til complexes sont séparés complètement. La méthode repose sur des techniques et des matériaux familiers à la plupart des biologistes moléculaires, ce qui signifie qu'il est peu coûteux et facile à apprendre. Bien qu'il soit limité dans sa capacité à séparer suffisamment complexes de très grande taille, et n'a pas été universellement avec succès, la méthode a été en mesure de capturer une grande variété de complexes bien étudiés, et probablement applicable à de nombreux systèmes d'intérêt.
Introduction
La fonction cellulaire normale est dépendante des interactions protéine-protéine 1, 2. En conséquence, les maladies humaines sont souvent marqués par des perturbations dans l'assemblage et le comportement de différents complexes protéiques 3. La capacité de caractériser ces interactions est donc essentiel. Les moyens actuels de détection de ces interactions nécessitent la purification des protéines cibles, souvent suivies de pull-down de leurs partenaires d'interaction. Purification classique est réalisée par centrifugation différentielle, la précipitation, et / ou Chromatographie 4. Ces méthodes sont de temps, doivent être modifiés pour chaque protéine cible, et donnent souvent lieu à des rendements faibles. Méthodes de purification modernes impliquent la fusion des balises de peptides à des protéines cibles, suivie par une immunoprécipitation ou par extraction sur des colonnes chargées avec des billes liées à une molécule de capture 5,« > 6. Bien que ce soit extensible à de nombreuses protéines, il nécessite une modification de la séquence de la cible, ce qui pourrait entraîner des constructions qui diffèrent par affinité pour leurs partenaires de liaison habituels. La nature délicate de certaines interactions protéine-protéine signifie que cette méthode ne peut pas être applicable de nombreux scénarios. de plus, les tests déroulants utilisés pour cartographier les interactions protéine-protéine ne peut pas capturer une image précise cellulaire, en raison de degrés de liberté restreints et les niveaux non natifs de la protéine appât.
Idéalement, les complexes de protéines pourraient être détectés dans leur état d'origine, sans nécessiter de purification ou de tirer vers le bas. Natif bleu électrophorèse sur gel de polyacrylamide (BN-PAGE) a été développé comme une alternative moins dénaturant à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), et permet la séparation de certaines protéines et des complexes à partir d' échantillons biologiques 7. Cependant, les protéines dans la base BN-PAGE séparent sur un large nombre de variables, y compris la taille, la charge, la structure en trois dimensions, et l'association avec d'autres molécules. Les interactions de ces facteurs se traduisent souvent par co-séparation des protéines, la formation d'agrégats, et une mauvaise résolution de la bande de protéine. Électrophorèse bidimensionnelle sur gel natif de polyacrylamide résout certains, mais pas tous, de ces problèmes 8.
Pour éviter les complications associées à la séparation native, certains auteurs utilisent des réactifs de reticulation réactifs avec les amines, telles que dithiobis (propionate de succinimidyle) (DSP), pour capturer des complexes protéiques dans les lysats de tissu 4. Ces lysats traités peuvent ensuite être dénaturés et séparés par SDS-PAGE, tout en conservant la taille native et le maquillage des complexes de protéines. Cependant, étant donné que les réactifs de réticulation réagissent en fonction de la proximité d'une molécule à l'autre, et les protéines dans les lysats de tissus ont beaucoup de degrés de liberté et peut interagir stochastiquement, croix de fond non spécifique-linking peut être élevé, en particulier dans les échantillons concentrés. Cela peut conduire à des résultats difficiles à interpréter.
Ici, nous démontrons l'utilisation d'un procédé hybride BN-PAGE / SDS-PAGE, appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide-multimère (multimère-PAGE), pour séparer et détecter des assemblages de protéines dans des mélanges complexes. Dans un premier temps, le lysat cellulaire est mis en suspension dans un gel de polyacrylamide via BN-PAGE. Le gel contenant de l'lysat est ensuite mis à réagir avec le réactif de réticulation DSP. Pseudo-immobilisé et légèrement séparés sur le gel, les protéines sont beaucoup moins susceptibles de réagir de façon non spécifique, ce qui signifie fond réactivité de réticulation est réduite. Après la reticulation, les bandes de gel sont excisées et séparées par SDS-PAGE. Le gel obtenu peut être ensuite analysé par tout moyen généralement associés à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode permet la séparation et la détection des complexes de protéines natives dans un lysat de tissu non modifié, sans la nécessité d'une purification supplémentaire ou pull-down.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les interactions protéine-protéine sont importantes pour tous les êtres vivants réalisent la tâche. En raison de cela, ils font l'objet d'un examen minutieux et de la recherche. Multimère-PAGE est un nouveau procédé pour la saisie, la séparation et l'analyse d'une large gamme de complexes de protéines. Nous avons déjà démontré son applicabilité à l' étude oligimerization de la protéine associée à la maladie α-synucléine 11. Cependant, il est extensible à…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pris en charge par le NIH / NIDA DA034783. Nous tenons à remercier Bryan A. Killinger d'assistance technique avec le multimère-PAGE.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
Riferimenti
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