다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지
Summary
안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.
Abstract
정화 및 단일 단백질과 펩티드를 연구하는 많은 잘 개발 된 방법이 있습니다. 그러나, 대부분의 세포 기능들은 그들의 비공유 쉽게 정제 기술에 의해 교란 바인딩 때문에 조사하기 어려운 작용 단백질 복합체의 네트워크에 의해 수행된다. 이 작업은 안정화 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용하여 개질 된 조직으로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법을 설명한다. 조직 파쇄 액은 단백질 겔로 짧은 거리를 마이그레이션 될 때까지 전류를인가하고, 비 변성 청색 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩된다. 이주 된 단백질을 함유하는 겔 조각은 절제하고 공유 단백질 복합체를 안정화 아민 반응성 가교 시약 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 함께 배양된다. 가교 결합 된 복합체를 포함하는 겔 스트립이어서 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔에 캐스팅되고, t그는 단지가 완전히 분리된다. 이 방법은 저렴하고 쉽게 배울 수 의미, 기술과 대부분의 분자 생물 학자들에게 친숙한 소재에 의존한다. 이 적절 매우 큰 단지를 분리하는 능력에 제한되고, 보편적으로 성공하지 않은 반면, 방법은 잘 연구 단지의 다양한 캡처 할 수 있었고, 관심이 많은 시스템에 가능성이 적용됩니다.
Introduction
정상 세포 기능은 단백질 – 단백질 상호 작용 1, 2에 따라 달라집니다. 그 결과, 인간의 질병은 종종 다양한 단백질 복합체 (3)의 조립 및 행동 교란에 의해 표시된다. 이러한 상호 작용의 특성을 할 수있는 능력 때문에 중요하다. 이러한 상호 작용을 검출하는 수단은 현재 자주 상호 작용 파트너 풀다운 하였다 목적 단백질의 정제를 필요로한다. 통상적 인 정제를 차동 원심 분리, 침전, 및 / 또는 크로마토 그래피 (4)에 의해 달성된다. 이 방법은 시간이 많이 소요되어 각 대상 단백질을 변경해야합니다, 종종 낮은 수율을 초래한다. 현대 정제 방법은 포획 분자 (5)에 결합 된 비드 로케이션 컬럼에 면역 또는 추출하여 단백질을 표적으로하는 펩티드 태그의 융합을 포함이것은 많은 단백질 신성이지만 "> 6. 그것은 잠재적으로 보통 결합 파트너에 대한 친 화성이 다른 구조의 결과, 타겟의 순서 변경을 필요로한다. 일부 단백질 – 단백질 상호 작용에 민감한 성질은이 방법이 적용되지 않을 수 있음을 의미 많은 시나리오. 또한, 단백질 – 단백질 상호 작용을 매핑하는 데 사용 풀다운 분석으로 인해 자유와 미끼 단백질의 비 네이티브 수준의 제한된 도로, 정확한 세포 사진을 캡처 할 수 있습니다.
이상적으로, 단백질 복합체가 정화 또는 풀다운 할 필요없이, 그 나라의 상태를 검출 할 수있다. 블루 천연 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법 (BN-PAGE)의 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE)에 덜 변성 대안으로 개발 및 생체 시료 7의 일부 단백질 복합체의 분리를 허용 하였다. 그러나, BN-PAGE 단백질은 LAR에 기초하여 구분하기다른 분자 크기, 전하, 입체 구조, 및 결합을 포함한 변수의 GE 번호. 이러한 요소의 상호 작용은 종종 단백질의 공동 분리, 집계 형성, 가난한 단백질 밴드 해상도를 초래한다. 두 차원 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 이러한 문제 8의 모든 일부를 해결 있지만.
기본 분리와 관련된 합병증을 피하기 위해, 일부 저자는 조직 해물 4 단백질 복합체를 캡처하는 등의 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 같은 아민 반응성 가교 시약 (DSP)를 사용합니다. 이 처리 해물을 다음 변성 및 단백질 복합체의 원래 크기와 메이크업을 유지하면서, SDS-PAGE에 의해 분리 될 수있다. 가교 시약이 조직 용해 액에 다른 한 분자의 근접성, 그리고 단백질을 기반으로 반응하기 때문에, 많은 자유도를 가지고 확률 적, 비특이적 배경 크로스를 상호 작용할 수 있습니다-linking 특히 농축 샘플에서 높을 수있다. 이 어려운-해석 결과로 이어질 수 있습니다.
여기서는 하이브리드 BN-PAGE / SDS-PAGE 법의 사용을 입증 분리 복잡한 혼합물에 단백질 어셈블리를 감지하는 멀티 머 – 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (다량 체-PAGE)을 불린다. 우선, 세포 용 해물을 통해 BN-PAGE 폴리 아크릴 아미드 겔에 현탁시킨다. 용 해물을 함유하는 겔은 가교 시약 DSP와 반응시킨다. 의사 고정화 약간 겔상에서 분리 된 단백질은 배경 가교제의 반응성이 감소 의미 훨씬 비특이적 반응 할 가능성이있다. 가교 후, 겔 밴드를 절제하고 SDS-PAGE로 분리 하였다. 생성 된 겔은 전형적 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법과 연관된 임의의 수단에 의해 분석 될 수있다. 이 방법은 추가로 정제 또는 당기 다우 없이도 변성 조직 파쇄물에서 천연 단백질 복합체의 분리 및 검출을 허용엔.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 – 단백질 상호 작용은 생물이 수행하는 모든 작업에 중요하다. 이 때문에, 그들은 강렬한 조사 및 연구의 주제이다. 다량 체-PAGE는 캡처 분리 및 단백질 복합체의 다양한 분석을위한 신규 한 방법이다. 우리는 이전에 질병 관련 단백질의 α-synuclein의 11 oligimerization 연구에의 적용 가능성을 증명하고있다. 그림 2에서 설명하지만, 그것은 많은 단백질 복합체로 확…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
국립 보건원 / NIDA의 DA034783 지원. 우리는 다량 체-PAGE와 기술 지원 브라이언 A 킬링거합니다.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
Riferimenti
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
