Summary

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Published: May 05, 2017
doi:

Summary

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Abstract

Er zijn veel goed ontwikkelde methoden voor het zuiveren en bestuderen van enkele eiwitten en peptiden. Echter, de meeste cellulaire functies worden uitgevoerd door netwerken van interactie-eiwitcomplexen, die vaak moeilijk te onderzoeken zijn, omdat hun binding niet-covalent is en gemakkelijk verstoord wordt door zuiveringstechnieken. Dit werk beschrijft een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsel door gebruik te maken van tweedimensionale polyacrylamide gelelektroforese. Weefsellysaat wordt geladen op een niet-denaturerende blue-native polyacrylamidegel, dan wordt een elektrische stroom aangebracht totdat het eiwit een korte afstand in de gel migreert. De gelstrook die het gemigreerde eiwit bevat, wordt dan uitgesneden en geïncubeerd met het amine-reactieve verknopingsreagensdithiobis (succinimidylpropionaat) dat eiwitcomplexen covalent stabiliseert. De gelstrook die verknoopte complexen bevat, wordt dan gegoten in een natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel en tHij complexen zijn volledig gescheiden. De methode is gebaseerd op technieken en materialen bekend bij de meeste moleculaire biologen, wat betekent dat het is goedkoop en makkelijk te leren. Terwijl het is beperkt in haar vermogen om adequaat te scheiden extreem grote complexen, en is nog niet universeel succesvol geweest, de methode was in staat om een ​​breed scala van goed bestudeerde complexen vast te leggen, en is waarschijnlijk van toepassing op veel systemen van belang.

Introduction

Normale cellulaire functie is afhankelijk eiwit-eiwitinteracties 1, 2. Daardoor worden menselijke ziekten vaak gekenmerkt door verstoringen in de assemblage en het gedrag van verschillende eiwitcomplexen 3. Het vermogen om dergelijke interacties te karakteriseren is daarom cruciaal. Gangbaar detecteren van deze interactie vereist zuivering van doeleiwitten, vaak gevolgd door pull-down hun interactie partners. Klassieke zuiveringstechniek wordt bereikt door differentiële centrifugatie, precipitatie en / of chromatografie 4. Deze werkwijzen zijn tijdrovend, moeten zij gedurende elk doelwiteiwit, vaak leiden tot lage opbrengsten. Moderne zuiveringsmethoden omvatten de fusie van peptidelabels om eiwitten te richten, gevolgd door immuunprecipitatie of extractie op kolommen beladen met kralen gebonden aan een vangmolecuul 5,"> 6. Hoewel dit rekbaar veel eiwitten, vereist sequentie modificatie van het doel, wat mogelijk tot constructies die verschillen in affiniteit voor hun gebruikelijke bindingspartners. De gevoelige aard van bepaalde eiwit-eiwit interacties betekent deze werkwijze niet van toepassing is te veel scenario's. Daarnaast is de pull-down assays gebruikt om in kaart eiwit-eiwit interacties kunnen geen nauwkeurige cellulaire beeld vast te leggen, als gevolg van beperkte mate van vrijheid en non-native niveaus van het aas eiwit.

Idealiter zou eiwitcomplexen worden gedetecteerd in hun eigen staten, zonder de noodzaak van zuivering of pull-down. Blauw natieve polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) werd ontwikkeld als een minder denaturerende alternatief natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en maakt de scheiding van sommige eiwitten en complexen uit biologische monsters 7. Echter, eiwitten in BN-pagina's te scheiden op basis van een LARge aantal variabelen, zoals grootte, lading, driedimensionale structuur, en samen met andere moleculen. De interactie van deze factoren leiden vaak tot co-scheiding van eiwitten, aggregaatvorming en slechte eiwitband resolutie. Tweedimensionale native-polyacrylamidegelelektroforese lost sommige, maar niet alle, van deze problemen 8.

Om de complicaties van natief scheiding omzeilen sommige auteurs amine-reactieve verknopingsmiddelen, zoals dithiobis (succinimidylpropionaat) (DSP), om eiwitcomplexen te vangen in weefsellysaten 4. Deze behandelde lysaten kunnen vervolgens worden gedenatureerd en gescheiden door SDS-PAGE, met behoud van de oorspronkelijke afmeting en samenstelling van eiwitcomplexen. Aangezien verknoping reagentia reageren op basis van de nabijheid van één molecuul naar een ander, en eiwitten in weefsellysaten veel vrijheidsgraden en kan communiceren stochastisch niet-specifieke achtergrond kruis-linking kan hoog zijn, vooral in geconcentreerde monsters. Dit kan leiden tot moeilijk te interpreteren resultaten.

Hier tonen we het gebruik van een hybride BN-PAGE / SDS-PAGE-werkwijze, aangeduid als multimeer-polyacrylamidegelelektroforese (multimeer-PAGE), te scheiden en te detecteren eiwit samenstellingen in complexe mengsels. Aanvankelijk wordt cellysaat gesuspendeerd in polyacrylamidegel via BN-PAGE. Het lysaat bevattende gel wordt vervolgens met de verknopingsreagens DSP. Pseudo-geïmmobiliseerde en enigszins gescheiden op gel, eiwitten veel minder kans op niet-specifieke wijze reageren, waardoor achtergrond verknopingsmiddel reactiviteit wordt verminderd. Na verknoping wordt het gel banden uitgesneden en gescheiden via SDS-PAGE. De verkregen gel kan vervolgens worden geanalyseerd met alle middelen die gewoonlijk met polyacrylamidegelelektroforese. Deze werkwijze maakt de scheiding en detectie van eiwitcomplexen in ongemodificeerde weefsel lysaat zonder de noodzaak van extra zuivering of pull-down.

Protocol

1. Weefselbereiding Bereid 10 ml 4x BN-PAGE monsterbuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methaan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v glycerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). LET OP: Deze voorraad oplossing kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen bij 4 ° C. Verdunnen 250 ul van 4x monsterbuffer in 750 pi dH 2 O uit 1x commerciële proteaseremmercocktail. Vortex en te rusten op ijs. Homogeniseer 20 mg doelweefsel in 1 ml 1x ijskoude BN-PAGE monsterbuff…

Representative Results

In dit demonstratie-experiment werd multimer-PAGE uitgevoerd op gehele rat hersenlysaat. De resulterende gescheiden eiwitten werden op polyvinylideendiflouride (PVDF) membranen geblazen en vervolgens getest met antilichamen tegen eiwitten die bekend zijn om complexen te vormen. Figuur 1 toont een validatie van het protocol op twee manieren. Ten eerste tonen wij aan dat de verknoopte eiwitten splitsbaar zijn door toevoeging van een reductiemiddel, wat betekent dat de waar…

Discussion

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor elke taak levende dingen uit te voeren. Vanwege dit, ze zijn het onderwerp van intensief onderzoek en onderzoek. Multimeer-PAGE is een nieuwe werkwijze voor het vastleggen, scheiden en analyseren van een breed scala van eiwitcomplexen. We hebben eerder aangetoond dat de toepasselijkheid ervan op het bestuderen van oligimerization van de ziekte-geassocieerde eiwit α-synucleïne 11. Het is echter uitbreidbaar vele eiwitcomplexen, zoals aangetoond in <st…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ondersteund door de NIH / NIDA DA034783. Wij danken Bryan A. Killinger voor technische bijstand met het multimeer-PAGE.

Materials

Chemicals
ε-Aminocaproic acid Sigma A2504
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) BioRad 161-0148 Toxic.
Ammonium persulfate Sigma A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit Thermofisher 23225
Bis-tris Sigma B9754
Bovine serum albumin Sigma A9647
Butanol Fisher Scientific A399-1
Chemiluminescence substrate kit ThermoFisher 24078
Coomassie blue G-250 Sigma-Aldrich B0770
Digitonin Sigma D141 Toxic.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate) Thermo Scientific 22585
Dry nonfat milk LabScientific M0841
Glycerol Sigma G9012
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail Thermofisher 78430
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144SI-212 For titration. Caustic.
Methanol Fisher Scientific A412-4 For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Sigma T9281
N,N'-methylenebisacrylamide Acros Organics 16479 Toxic.
NP40 Boston Bioproducts P-872
Polysorbate 20 (tween-20) Fisher Scientific BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes Thermo Scientific 88518
Ponceau S Sigma P3504
Potassium chloride Fisher Scientific P217-3
Potassium phosphate monobasic Sigma P9791
Protease inhibitor cocktail Thermo Scientific 88265
SDS solution (10% w/v) BioRad 161-0416
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium dodecyl sulfate Sigma L37771
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-1
Tricine Sigma T0377
Tris base Fisher Scientific BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) BioRad 161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) BioRad 161-0798
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000 GE Healthcare 28-9558-10
ImageJ software NIH
Synergy H1 microplate reader BioTek
Gel Former + Stand Biorad
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer Fisher Scientific FB120220

Riferimenti

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  3. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
  4. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
  5. Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  7. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  8. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  10. Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
  11. Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
  12. Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
  13. Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
  14. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  15. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
  16. Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
  17. Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
  18. Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
  19. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).

Play Video

Citazione di questo articolo
Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples. J. Vis. Exp. (123), e55341, doi:10.3791/55341 (2017).

View Video