متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية
Summary
وتقدم (PAGE) نظام طريقة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من المحللة أنسجة معدلة باستخدام بروتين عبر رابط-أمين رد الفعل مضافا إلى رواية اثنين من الأبعاد هلام بولي أكريلاميد الكهربائي.
Abstract
هناك العديد من وسائل متطورة لتنقية ودراسة البروتينات واحدة والببتيدات. ومع ذلك، يتم تنفيذ معظم الوظائف الخلوية من قبل شبكات مجمعات البروتين التفاعل، والتي غالبا ما تكون صعبة للتحقيق بسبب تجليدها هو غير التساهمية ومضطرب بسهولة عن طريق تقنيات تنقية. يصف هذا العمل وسيلة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من أنسجة معدلة باستخدام ثنائي الأبعاد بولكرلميد الكهربائي للهلام. يتم تحميل الأنسجة المحللة على غير تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الأزرق الأصلي، ثم يتم تطبيق تيار كهربائي حتى يهاجر البروتين على بعد مسافة قصيرة في هلام. قطاع هلام يحتوي على بروتين ترحيلها ثم يتم رفعه وحضنت مع dithiobis-أمين رد الفعل عبر ربط الكاشف (succinimidyl بروبيونات)، والتي تستقر تساهميا مجمعات البروتين. قطاع هلام يحتوي على مجمعات عبر ربط ثم يتم صبها في دوديسيل الصوديوم هلام كبريتات بولي أكريلاميد، وريتم فصل انه المجمعات تماما. ويعتمد هذا الأسلوب على التقنيات والمواد مألوفة لمعظم علماء الأحياء الجزيئية، وهذا يعني أنها غير مكلفة وسهلة التعلم. بينما هي محدودة في قدرتها على فصل كاف مجمعات كبيرة للغاية، ولم تكن ناجحة عالميا، كانت الطريقة قادرة على التقاط مجموعة واسعة من المجمعات مدروسة، وينطبق المرجح أن العديد من الأنظمة المثيرة للاهتمام.
Introduction
وظيفة الخلوية العادية تعتمد على تفاعلات البروتين البروتين 1 و 2. ونتيجة لذلك، وغالبا ما يتم وضع علامة الأمراض التي تصيب الإنسان من الاضطرابات في التجمع وسلوك مختلف المجمعات البروتين 3. القدرة على تميز هذه التفاعلات هي بالتالي حرجة. تتطلب الوسائل الحالية للكشف عن هذه التفاعلات تنقية البروتينات المستهدفة، وغالبا ما تليها المنسدلة من شركاء التفاعل بهم. ويتم إنجاز تنقية التقليدية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي، وهطول الأمطار، و / أو اللوني 4. هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، ويجب تغييرها لكل بروتين الهدف، وغالبا ما تؤدي إلى عوائد منخفضة. وتشمل أساليب تنقية الحديثة انصهار علامات الببتيد لاستهداف البروتينات، تليها مناعي أو استخراج على أعمدة محملة الخرز بد أن جزيء القبض على 5،"> 6. ولئن كان هذا للمد إلى العديد من البروتينات، فإنه يتطلب تسلسل تعديل الهدف، ما قد يؤدي في التركيبات التي تختلف في تقارب للشركاء ملزم المعتادة، والطبيعة الحساسة لبعض تفاعلات البروتين البروتين يعني هذا الأسلوب قد لا تكون قابلة للتطبيق في العديد من المواقف. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات المنسدلة استخدامه لتعيين تفاعلات البروتين البروتين قد لا التقاط صورة الخلوية دقيقة، نظرا لدرجة المقيدة للحرية ومستويات غير الأصلية من البروتين الطعم.
من الناحية المثالية، يمكن أن يتم الكشف عن بروتين المجمعات في دولهم الأم، دون الحاجة إلى تنقية أو المنسدلة. وقد وضعت الأزرق الأصلي الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (BN-PAGE) كبديل أقل تغيير طبيعة لالصوديوم دوديسيل الكهربائي كبريتات بولي أكريلاميد هلام (SDS-PAGE)، ويسمح لفصل بعض البروتينات والمجمعات من العينات البيولوجية 7. ومع ذلك، والبروتينات في BN-صفحة منفصلة على أساس لارعدد جنرال الكتريك من المتغيرات، بما في ذلك حجم، تهمة، هيكل ثلاثي الأبعاد، وبالتعاون مع جزيئات أخرى. تفاعلات هذه العوامل كثيرا ما يؤدي إلى شارك في فصل البروتينات، وتشكيل الكلي، وضعف القرار الفرقة البروتين. ثنائي الأبعاد الأصلي-إس دي إس بايج حل بعض، ولكن ليس كل شيء، من هذه المشاكل 8.
للالتفاف على التعقيدات المرتبطة بفصل الأصلي، واستخدام بعض الكتاب الكواشف أمين التفاعلي عبر ربط، مثل dithiobis (succinimidyl بروبيونات) (DSP)، لالتقاط مجمعات البروتين في الأنسجة لست] (4). ويمكن بعد هذه لست] يعامل أن التشويه والتحريف ومفصولة SDS-PAGE، مع الحفاظ على حجم الأصلي وماكياج المجمعات البروتين. ومع ذلك، منذ الكواشف عبر ربط تتفاعل على أساس القرب من جزيء واحد إلى آخر، والبروتينات في أنسجة لست] ديك العديد من درجات الحرية ويمكن أن تتفاعل عشوائيا، عبر خلفية غير محدد-linking يمكن أن تكون عالية، وخاصة في عينات المركزة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نتائج صعبة إلى تفسير.
هنا، علينا أن نظهر استخدام الأسلوب الهجين BN-PAGE / SDS-PAGE، ووصف متعدد القسيمات-بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (متعدد القسيمات-PAGE)، لفصل وكشف المجالس البروتين في الخلائط المعقدة. في البداية، يتم تعليق المحللة خلية في هلام بولي أكريلاميد عبر BN-PAGE. هلام التي تحتوي على المحللة بعد ذلك كان رد فعل مع كاشف DSP عبر ربط. ويفصل على هلام قليلا-يجمد الزائفة، والبروتينات هي أقل عرضة للرد nonspecifically الكثير، وهذا يعني تقليل الخلفية عبر رابط التفاعل. بعد عبر ربط، يتم استئصال العصابات جل وفصلها عن طريق SDS-PAGE. ثم يمكن تحليلها هلام الناتجة بأي وسيلة ترتبط عادة مع الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد. وتسمح هذه الطريقة لفصل والكشف عن بروتين المجمعات المحلية في المحللة أنسجة معدلة، دون الحاجة لتنقية إضافية أو سحب-داون.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاعلات البروتين البروتين مهم لكل مهمة الكائنات الحية تنفذ. وبسبب هذا، فهي موضوع تدقيق مكثف والبحوث. متعدد القسيمات-PAGE هي طريقة جديدة لالتقاط وفصل، وتحليل مجموعة واسعة من المجمعات البروتين. لقد أثبتنا سابقا تطبيقه لدراسة oligimerization من الأمراض المرتبطة البروتين α-synuclei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من DA034783 NIH / النداء. نشكر بريان A. كيلينجر للحصول على المساعدة الفنية مع متعدد القسيمات-PAGE.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
Riferimenti
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
