Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
yapıcı biyoloji ve yapay bir yaşam oluşturmak için sentetik biyoloji yaklaşımı biyolojik veya biyolojik olmayan materyallerin aşağıdan yukarıya düzeneğini içerir. Bu tür yaklaşımlar yaşam ve cansız madde arasındaki sınırda araştırma önem aldık ve son yirmi yılda yapay hücreleri oluşturmak için kullanılır olmuştur. Özellikle, Dev veziküller (GV) çoğu zaman yapay hücre membran olarak kullanılmıştır. Bu yazıda, son derece yoğun biyomoleküllerin içeren hücrelerin bir model olarak oldukça dolu mikroküreler encapsulating GVs hazırlanmasını tarif etmektedir. GV basit bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifügasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Spesifik olarak, bir homojenleştirici malzeme kapsüllenecek ihtiva eden sulu bir çözelti ve çözünmüş fosfolipid ihtiva eden bir yağ emülsiyon haline getirmek için kullanılan ve elde edilen emülsiyon bir sulu çözeltinin yüzey dikkatle tabakalanmıştır. Tabakalı sistem, ardından t santrifüjlenmiştiro GV oluşturmak. Bu güçlü yöntem, küçük moleküllerden mikrosferler kadar maddeleri kapsüllemek için kullanılmıştır.
yapıcı, ya da sentetik biyoloji yaklaşımı yaşam arasındaki sınırı keşfetmek ve konuyu cansız için büyüleyici bir cadde. Hücre yaşam için gerekli asgari birim olduğundan şu anda anladığımız gibi çeşitli araştırmacılar, yapay hücrelerin içinde meydana gelen olaylar ele alınabilir ve böylece açıklık nihai hedefi, basit, iyi anlaşılmış kimyasallardan yapay hücreleri oluşturmak için çalıştılar hayatın kökeni ve canlı hücreler 1, 2, 3 temel fonksiyonları okuyor. Özellikle, 4 veziküller, amfifilik moleküllerden oluşan küresel microcompartments ve bu tür proteinlerin 5, 6 ve DNA 7, 8, 9 biyolojik moleküllerin kapsülleyen olanlass = "xref"> 10, genellikle biyolojik membranların model olarak kullanılmıştır.
Vesiküller, büyük (çapı <1 um), veya dev (çapı> 1 um) (<100 nm arasında bir çapa sahip olarak tanımlanmıştır), küçük olarak sınıflandırılabilir. bu boyut, şekil ve yapıda canlı hücreler benzer çünkü Dev veziküller (GV) yaygın olarak incelenmiştir. GVs büyüklüğü nedeniyle, GV membran morfolojik değişiklikleri kolayca bir optik mikroskop altında, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.
GV hazırlanması için bir çok yöntem sıvı alımı yöntemi 12, 13, donma-çözülme yöntemi 14, electroformation yöntemi 15, 16 ve sıvısal cihaz yöntemi 17, 18 dahil olmak üzere, 11 bildirilmiştir. Bununla birlikte, kapsülleme proteinler ve diğer MACROMBu yöntemler vasıtasıyla yüksek konsantrasyonlarda GVs bölgesindeki olecules zordur. Özellikle, hücre 19, 20 içinde kalabalık bir ortamda taklit etmek için yeterli miktarda (20-30 hacim olarak%) biyolojik malzemelerin kapsüllenmesi için son derece zordur. GV anında Weitz ve çalışma arkadaşları, emülsiyon santrifügasyon yöntemi 21, 22 (w / o), bir su-içinde-yağ tesis oluşturmak. Bu yöntem, beş önemli özelliklere sahiptir. Bu yöntemle hazırlanan GVs düşük lameller 23, 24, çünkü İlk olarak, kendi membranlar kolayca deforme olabilir, böylece ince. FtsZ (bakteriyel hücre bölünmesi proteini), tübülin ve diğer makromoleküller tarafından uyarılan GV membran deformasyon, 27, 26, 25 28 incelenmiştir, ve polyhe gözlenen mikro-29, 30 kapsüllenmesi ile indüklenen GV membran Dron benzeri deformasyon. İkinci olarak, zar proteinleri zorluk 31 ile de olsa, bu yöntemle, veziküler membran içine sokulabilir. Örneğin, Yomo grup membran proteini α-hemolizin 32 in vitro sentezini ve gözenek oluşturucu etkinliğini incelemek için bu yöntem kullanılır. Üçüncü olarak, iç ve dış broşür lipid bileşenleri, farklı 22 olan asimetrik GVs üretmek mümkündür. Örneğin, Whittenton ve diğ. negatif yüklü polinükleotidleri saklanması iç talimatında katyonik lipidler, ve dış broşürde nötr lipidler ile oluşturulan asimetrik GV toksisite ve nonspesifik hücresel alımı 33 azaltmak için. Dördüncü olarak, GVs içindeki maddelerin konsantrasyon ve hacim fraksiyonu nispeten yüksek olabilirs = "xref"> 28, 34. Beşinci olarak, malzeme birden fazla türde 35 kapsüllenebilir. Örneğin, Nishimura ve diğ. GVs içine bir in vitro transkripsiyon-translasyon sistemi kapsüllenmiş ve GVs 36 olan yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek için sistem kullanılır. Bu beş özellik emülsiyon santrifüj hücre taklit Gvs üretmek için vazgeçilmez bir yöntem w / o olun.
Önceki çalışmada, santrifüj ile oluşturulan GVs nihai sulu çözeltinin 22 bazı içeren uzun 16 G, paslanmaz çelik bir iğne ile donatılmış bir şırınga vasıtasıyla toplanmıştır. deneyimsiz teknisyenleri elinde, bu toplama yöntemi kolayca yağ bazı GV kirlenmesine neden olabilir. Bu çalışmada,, Yomo grup 23, 37 tarafından geliştirilen s / y emülsiyonu santrifüj protokolü kullanılanbir delik de hazırlanmış olan santrifüj tüpünün tabanına açılan yoluyla hangi çökelmiş GVs toplanır. Biz hücre içi organellere boyutunda benzer 1.0 mikron mikroküreler, kapsülleme Gvs hazırladı. mikroküreler kullanımı bize onların hacim fraksiyonu hesaplayarak kendi konsantrasyonunu tahmin etmek izin verdi. Malzemeler yoğun şekilde paketlenmiş edildiği GVs hazırlanması için bir yöntemin oluşturulması yapay hücreleri oluşturmak için önemli bir adımdır. İç malzeme türleri için protokol yararını teyit etmek için, daha da GFP ve küçük bir suda çözünür floresan molekül (Uranine) GVs kapsüllenmiş edilebilir olduğunu göstermiştir.
İç sulu bir dispersiyon ortamı ve dış sulu çözelti Özgül ağırlıklar dikkatle seçilmelidir. s / y emülsiyonu santrifüj sırasında dış sulu çözelti içine çökmesi için, bir iç sulu dispersiyon ortamının belirli özgül ağırlığı, dış sulu solüsyon daha büyük olması gerekir. Biz şeker olmadan iç ve dış çözümleri kullanılarak Gvs hazırlamak için çalıştı, ama iç sulu çözelti iki faz arasındaki paraziti geçmeye yeterli kütleye sahip değildi çünkü biz, bu koşullar altında hiçbir Gvs aldı. küçültmek veya yırtılması olabilir dış sulu çözelti içine çökelti iki çözümleri, GVs arasında büyük bir ozmotik basınç farkı varsa. Bu nedenle, iç ve GVs dışında ozmotik basıncı eşit olmalıdır. Bunu gerçekleştirmek için, dış sulu çözelti içinde çözünen olarak iç sulu dispersiyon ve glikoz bir çözünen olarak sukroz kullanılır; Her iki şekerler aynı konsantrasyonda edildi. Hem tuzP = "xref"> 22 ve şeker 23, 35, 38 bu amaçlar için kullanılmaktadır, ancak bu daha az toksik ve tuz daha çözünür olduğu için, şeker, genellikle kullanılır. Çok fazla şeker ilave edilir Ancak, GVs kapak cam ve çöküşün alt ile temas edebilir. Bu kaçınmak için çeşitli stratejiler vardır. Bir strateji, GV, ılımlı koşullar altında çökeltilmesi için, iç ve dış sulu çözeltiler arasındaki yoğunluk farkı azaltmak için; özel olarak ise, çökeltilmiş GV dispersiyon yüzer kaldırma kuvveti sonucu kapak camı yapışma yoluyla veziküler kopma ihtimalini azaltmak için, iç sulu çözeltiye aynı olan bir çözelti ile değiştirilebilir. Başka bir strateji ince lipid filmine 29 kapak gözlük hem ön kaplama etmektir.
emülsiyonun hazırlamayı ve kuluçka edilirönemli. Petrol çözeltisi hazırlamak için, sıvı parafin kullanılır. Madeni yağ 26, 31, 21 dodekan, 33 ve skualen 33, 39, genellikle bir çözücü yağ olarak kullanılır. Bu malzemeler, belirli yoğunluk, viskozite ve yüzey gerilimi değişiklik gösterdiğinden aynı santrifüj şartları 33 kullanıldığı zaman, veziküller farklı sayıda daha oluştururlar. Hedef özelliklere sahip veziküller elde etmek için, özgül ağırlığı ve iç ve dış sulu çözeltilerin viskozitesi ve yağ fazının santrifüj acceleration.For hazırlanmasını optimize esastır, inkübasyon yüksek sıcaklıkta ve kuru gerçekleşmelidir çevre bir kuluçka veya dehydrator gibi. Bu çalışmada, tamamen lipit molecules.In ilave çözmek için 80 ° C'ye kadar ısıtıldı sıvı parafin, emülsiyon olmalıdırgerekli ve o hazırlanan hemen sonra kararsız olduğu ve çünkü hemen santrifüj tabi olması gerektiği gibi sadece hazırlanacak damlacıkları kolayca birbirine kaynaştırmak w / o. Emülsiyon sonikasyon, vorteks veya dokunarak büyük miktarlarda elde edilebilir. Bununla birlikte, bir homojenleştirici kullanılarak yüksek viskozitede yağ içinde emülsiyon büyük miktarlarda hızlı hazırlanması ve daha kolay emülsiyon sağlar. Emülsiyon yumuşak ve hızlı bir şekilde ve 4 ° C'de, sonra soğutulmuş dış sulu çözeltisi üzerine yerleştirilmiş olması da önemlidir. emülsifikasyon ve santrifüj ile süresini kısaltmak için, yağ dış sulu çözelti sistemi emülsiyonu üzerinde katmanlı önce önceden soğutulmuş edilebilir beyaz türbidite hızlı veya daha yavaş normalden daha mekanik görünür immediately.If tüm sistemi daha sonra santrifüj edilebilir homojenleştirici iyice temizlik deterjanları kaldırmak için durulanması gerekir. Buna ek olarak, emülsiyon haline getirilmesinden önce, yağ çözeltisi, bir iç sulu bir çözeltisi ve emülsiyon yapıcı R olmalıdırOda sıcaklığına eturned.
Uygun merkezkaç ivme de önemlidir. 18,000 x g'da santrifüjleme ile, yüksek bir konsantrasyonda kapsüllenmiş tek bir iç malzeme ile GVs hazırlamak mümkün. birden fazla malzeme kapsülleme gerekli olduğunda, santrifüj ivme azaltmak için daha iyidir. Örneğin, yedi bileşikleri içine alan bir aktin montaj sistemi en az 350 x g 35 santrifüjleme ile elde edildi. Santrifüj arzu olduğu durumlarda, GVs şeker konsantrasyonu ayarlanarak ya da kendi kütlesinin 38, 40, 41 etkisi altında emülsiyonun çökeltilmesiyle elde edilebilir.
Burada bildirilen yöntem iki önemli sınırlamalar vardır. Weit tarafından işaret edildiği gibi bir GV zar içinde çözülmüş olabilir (bu durumda, parafin) petrol moleküllerz grubu 21. GV membran içine bir zar proteini yerleştirilmesi istendiğinde, protein üzerindeki eşlik eden yağ moleküllerinin dikkate alınmalıdır. diğer sınırlama hacim fraksiyonu çeşididir. Bu çalışmada, GVs mikrosfer hacmi fraksiyonları 4-30 Vol% arasında değişmektedir tahmin; birim fraksiyonlar GV hazırlanması için kullanılan iç sulu çözeltinin hacmi fraksiyonuna denk değildi. Bu mikroskop gözlem için yeterince yüksek bir hacim fraksiyonu en GVs içinde mikro-kapsüllenmesi için mümkün olmakla birlikte, bu yöntem, bir homojen hacim fraksiyonu dağılımı GVs hazırlanması için uygun değildir. Mikrosfer kesrinin dağılımı santrifüj 34 boyunca değişen bildirilmiştir.
s / y emülsiyonu santrifiij yöntemi yaygın olarak kapsüllenmiş malzemeler içeren GVs oluşumu için kullanılır. Ancak, az sayıda rapor p nitelendirdilermikro malzemeleri 34, 42 encapsulating GVs onarımı. Son zamanlarda, bir kapsüllenmiş DNA, aygıtı veya bir Moleküler Device içeren moleküler robotlar, 44 43 inşa edilmiştir. bölmeli GV uygulamalar bu tür için ilk seçenektir; Bu nedenle, çok çeşitli yüzey işlevsellik manyetik mikro-küreler ve mikro-kapsüllenmesi için kullanılabilir bizim gibi teknikler, 44 yararlı olması beklenebilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz Şekil 1'de şematik görüntüsünü çizim Tomoko Yamaguchi teşekkür ederiz. Bu çalışma Fen Bilimleri theNational Enstitüleri Bütünleştirici Bioscience için Okazaki Enstitüsü Okazaki ORION Projesi (NINS) tarafından desteklenmiştir; Astrobiyoloji Merkezi Projesi NINS ve (. No AB281010) tarafından; (. No 25102008) Yenilikçi Alanları Bilimsel Araştırma (entegre fonksiyonları oluşturulması için biyomoleküler sistemlerin dinamik sipariş) Bilim Teşvik Japonya Derneği için bir Grant-in-Aid (JSPS) tarafından; Genç Bilginler bir Grant-in-Aid (B) (KK, 15K17850 no.) JSP'lerden; andby bir Grant-in-Aid Araştırma Etkinlik Başlangıç için (YN için, hayır. 15H06653) JSP'lerden. Ek destek Noguchi Enstitüsü, Fen Kao Vakfı tarafından sağlanan hibe ve Kurita Su ve Çevre Vakfı hibe hibe sağlanmıştır.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |