Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
建設的な生物学や人工生命を作成する合成生物学のアプローチは、生物学的または非生物材料のボトムアップアセンブリを伴います。このようなアプローチは、リビングと非生物の物質との間の境界の研究にかなりの注目を受けているし、過去20年間の人工細胞を構築するために使用されてきました。特に、巨大な小胞(のGV)は、多くの場合、人工細胞膜として使用されています。本稿では、高度に凝縮し、生体分子を含有する細胞のモデルとして非常にパックされたマイクロスフェアをカプセル化するのGVの調製を記載しています。 GVは、単純な油中水型エマルションの遠心分離法を用いて調製しました。具体的には、ホモジナイザーは、材料をカプセル化することを含む水溶液に溶解し、リン脂質を含有する油を乳化するために使用し、そして得られたエマルジョンは、他の水溶液の表面上に注意深く積層しました。階層化システムは、次に、Tを遠心分離しOのGVを生成します。この強力な方法は、小分子からマイクロスフェアに至るまで材料をカプセル化するために使用されました。
建設的、または合成、生物学のアプローチは、リビングと非生物の物質との間の境界を探索するための魅力的な道です。細胞は、我々は現在、それを理解するように生活するために必要な最小単位であるため、様々な研究者が解明の究極の目標で、そのような人工細胞内で発生する現象を研究することができるようにシンプルな、よく理解の化学物質から人工細胞を構築しようとしました生命の起源と生細胞1、2、3の基本的な機能を研究。両親媒性分子からなる球状microcompartmentsであり、そのようなタンパク質5、 図6およびDNA 7、 図8、 図9のような生体分子をカプセル化することができ、特に、小胞4、小娘= "外部参照"> 10は、多くの場合、生体膜のモデルとして使用されています。
小胞は、(<100nmの直径を有するとして定義される)小大(直径<1ミクロン)、または巨大な(直径> 1ミクロン)に分類することができます。彼らは大きさ、形状、及び構造で生細胞と類似しているため、ジャイアントベシクル(のGV)が広く研究されています。 GVの大きさにより、GV膜における形態学的変化は、容易に光学顕微鏡下でリアルタイムで観察することができます。
GVを調製するためのいくつかの方法は、水和法12、13、凍結融解法14、電鋳法15、16、及び流体装置法17、18を含む、11に報告されています。しかし、タンパク質および他のMACROMを封入これらの方法により、高濃度でのGV中oleculesは困難です。特に、セル19,20の内部に混雑した環境を模倣するために十分な量(20〜30体積%)中の生物学的物質を封入することは極めて困難です。瞬時のGVを形成するために、ウェイツおよび共同研究者は、油中水型(W / O)エマルション遠心法21、22を確立しました 。この方法は、5重要な機能を備えています。この方法により調製のGVが低いラメラ23、24を持っているので、まず、それらの膜は、それらが容易に変形することができるように薄いです。 FtsZ(細菌の細胞分裂タンパク質)、チューブリン、および他の巨大分子によって誘導されるGV膜変形が25、26、27、28に研究されており、我々はpolyhe観察しましたマイクロスフェア29、30のカプセル化によって誘発されるGV膜のDRONのような変形。第二に、膜タンパク質は困難31とはいえ、この方法により、小胞の膜に挿入することができます。例えば、四方グループは、α溶血素32膜タンパク質のインビトロ合成と細孔形成活性を研究するために、このメソッドを使用していました。第三に、内側と外側のリーフレットの脂質成分は、22種類である、非対称のGVを生成することができます。例えば、Whittenton ら。毒性および非特異的な細胞取り込み33を減少させるために、負に帯電したポリヌクレオチドをカプセル化するための内部リーフレット中のカチオン性脂質と、そして外側のリーフレットに中性脂質非対称のGVを生成。第四に、のGV内部の物質の濃度および体積分率が比較的高くすることができますS = "外部参照"> 28、34。第五に、材料の複数のタイプが35を封入することができます。例えば、西村ら。 GVへのインビトロ転写-翻訳系をカプセル化のGV 36内に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するようにシステムを使用します。これらの5つの特徴は、W / Oエマルションの遠心分離を細胞模倣のGVを生成するための不可欠な方法を作ります。
以前の研究では、遠心分離によって生成のGVは、最終的な水溶液22の一部を含む長16 Gステンレス鋼針を備えたシリンジを用いて回収しました。経験の浅い技術者の手で、このコレクションの方法は、簡単に油の一部とGVの汚染につながる可能性があります。本研究では、四方群23、37によって開発されたW / Oエマルションの遠心分離プロトコルを使用しましたここでのGVは、それらが調製された遠心分離管の底部に開口穴を通って回収される沈殿しました。我々は、細胞内小器官のサイズに似ている1.0μmのマイクロスフェアを、カプセル化のGVを用意しました。微小球の使用は、我々は、それらの体積分率を計算することによって、それらの濃度を推定することができました。材料が密に充填されているのGVの製造方法の確立は、人工細胞を作成するための重要なステップです。内側の材料の様々なタイプの我々のプロトコルの有用性を確認するために、我々はまた、GFPおよび小さな水溶性蛍光分子(ウラニン)はのGV中に封入することができることを実証しました。
内部の水性分散媒と外水溶液の比重は、慎重に選択する必要があります。 W / Oエマルションは、遠心分離中に、外側の水溶液中に沈殿させるために、内側の水性分散媒の比重は、外側の水溶液よりも大きくなければなりません。私たちは、糖なしで内側と外側のソリューションを使用してのGVを準備しようとしましたが、内部の水溶液は、2つの相の間の干渉を横断するのに十分な質量を持っていなかったので、我々は、これらの条件の下で何のGVを得られません。二つの溶液間に大きな浸透圧の差がある場合、外側の水溶液中に沈殿のGVは、縮小または破壊することができます。したがって、のGV内側と外側の浸透圧は等しくなければなりません。これを達成するために、我々は外水溶液中の溶質として、内側水分散液とグルコースの溶質としてショ糖を使用しました。両方の糖は、同じ濃度でした。両方の塩SS = "外部参照"> 22と砂糖23、35、38は、このような目的のために使用されてきたが、それは塩よりも毒性が低い、より可溶性であるため、糖は、通常用いられています。あまりにも多くの砂糖を添加する場合は、のGVは、カバーガラスと崩壊の底部に接触することができます。これを回避するためのいくつかの方法があります。 1つの戦略は、のGVは、穏やかな条件下で沈殿するように、内側と外側の水溶液との比重差を低減することです。具体的には、沈殿したGV分散液の上清は浮力の結果としてのカバーガラスに接着することにより小胞の破裂の可能性を低減するために内側の水溶液と同じである溶液と交換することができます。別の戦略は、薄い脂質膜29とカバーガラスの両方をプレコートすることです。
エマルジョンの適切な準備とインキュベーションされています重要。我々は、油溶液を調製するために液体パラフィンを使用しました。鉱油26、31、21ドデカン、33、及びスクワラン33、39は、また、多くの場合、溶媒油として使用されます。これらの材料は、比重、粘度、及び表面張力が変化するため、小胞の異なる番号が同じ遠心分離条件は、33を用いても形成します。ターゲット特性を有する小胞を得るためには、比重内外水溶液の粘度、ならびに油相の遠心acceleration.For製剤を最適化するために不可欠であり、インキュベーションは、高温で、乾燥中に発生しなければなりません環境インキュベーターや脱水など。この研究では、我々は完全に脂質molecules.In加算を溶解するために80℃に流動パラフィンを加熱し、エマルジョンがすべき必要とそれを調製した直後に不安定であるため、すぐに遠心分離されるべきであるだけで調製された液滴は容易に互いに融合/ oをwです。エマルジョンは、超音波処理、ボルテックス、またはタップすることで、大量に調製することができます。しかしながら、ホモジナイザーを使用して高粘度の油中の乳剤の多量の迅速な調製および容易に乳化可能にします。エマルジョンを穏やかにかつ迅速に外側水溶液に積層した後、4℃で冷却することも重要です。乳化および遠心分離の間の時間を短縮するために、油 – 外側の水溶液系は、エマルジョンは、その上に積層される前に予備冷却することができ、白濁が速くまたは遅く通常よりも、機械的な表示immediately.Ifシステム全体は、次いで、遠心分離することができますホモジナイザーを徹底的にクリーニング用洗剤を除去するためにリンスしなければなりません。また、乳化前に、油剤、内側の水溶液、および乳化剤は、rでなければなりません室温にeturned。
適切な遠心加速度も重要です。 18,000×gで遠心分離することによって、我々は、高濃度でカプセル化された単一の内装材とのGVを準備することができました。複数の材料のカプセル化が必要な場合には、遠心加速度を低減した方がよいです。例えば、7の化合物を封入アクチン組立システム未満350×gで35での遠心分離によって達成されました。遠心分離は望ましくないである場合には、のGVは、糖濃度を調整することにより、または、独自の質量38、40、41の影響下で乳剤を沈殿させることによって得ることができます。
本明細書に報告された方法は、2つの主要な制限があります。 Weitによって指摘されているように、1つは、GV膜中に可溶化することができる(この場合パラフィン)その油分子でありますzのグループ21。 GV膜への膜タンパク質の挿入が所望される場合、タンパク質上に共存する油分子の効果を考慮しなければなりません。他の制限は、体積分率の変化です。本研究では、のGV中の微小球の体積分率は4-30体積%の範囲であったと推定しました。体積分率は、GVの調製に使用される内部の水溶液の体積分率と同一ではなかったです。我々は、顕微鏡観察のために十分に高い体積分率でのGV内のミクロスフェアを封入することができたが、この方法は、均一な体積分率分布を有するのGVの製造には適していません。微小球の体積分率の分布は、遠心分離34中に変化することが報告されています。
W / Oエマルションの遠心分離法は、一般的にカプセル化された物質を含むのGVの形成に使用されます。しかし、いくつかの報告は、pを記載していますマイクロスケール材料34、42をカプセル化するのGVの賠償金。最近では、カプセル化されたDNAデバイスや分子デバイスを含む分子ロボットは43、44を構築されています。コンパートメントのGVは、この種のアプリケーションのための最初の選択です。従って、多様な表面官能化磁気マイクロスフェア及びマイクロスフェアを封入するために使用することができるような我々のような技術が、44有用であると期待することができます。
The authors have nothing to disclose.
我々は、 図1に概略的な画像を描画するための山口智子に感謝します。この研究は、自然科学のtheNational研究所の岡崎統合バイオサイエンス研究所の岡崎ORIONプロジェクト(自然科学研究機構)によってサポートされていました。自然科学研究機構の宇宙生物学センタープロジェクト(。なしAB281010)によります。 (ノー25102008)革新的な分野での科学研究(統合された機能の作成のための生体分子システムの動的秩序)日本学術振興会からのための費補助金(JSPS)によります。若手費補助金(B)による(KKに、15K17850ありません。)日本学術振興会から。 andby費補助金研究活動スタートアップのための(YNに、なし。15H06653)日本学術振興会から。追加のサポートは野口研究所、財団法人花王芸術・科学財団からの助成金、および栗田工業と環境財団からの助成金からの助成金によって提供されました。
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |