Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
بيولوجيا البناء ونهج البيولوجيا التركيبية لخلق حياة اصطناعية تنطوي على التجمع من أسفل إلى أعلى من المواد البيولوجية أو غير بيولوجية. وقد حظيت هذه النهج قدرا كبيرا من الاهتمام في مجال البحوث على الحدود بين العيش والمواد غير الحية واستخدمت لبناء خلايا اصطناعية على مدى العقدين الماضيين. على وجه الخصوص، العملاق الحويصلات (مشاهد عامة) وغالبا ما تستخدم أغشية الخلايا الاصطناعية. في هذه الورقة، ونحن تصف إعداد مشاهد عامة التغليف المجهرية معبأة غاية كنموذج من الخلايا التي تحتوي على الجزيئات الحيوية مكثف للغاية. تم عن طريق وسيلة مستحلب الطرد المركزي بسيط الماء في النفط أعدت مشاهد عامة. على وجه التحديد، تم استخدام الخالط لاستحلب محلول مائي يحتوي على مواد إلى أن تكون مغلفة والنفط التي تحتوي على الدهون الفوسفاتية المنحل، والطبقات مستحلب الناتجة بعناية على سطح محلول مائي آخر. وبعد ذلك طرد نظام الطبقات رس توليد مشاهد عامة. وقد استخدمت هذه الطريقة قوية لتغليف المواد بدءا من الجزيئات الصغيرة إلى المجهرية.
على نهج البيولوجيا بناء، أو الاصطناعية هو وسيلة رائعة لاستكشاف الحدود بين العيش ومادة غير حية. لأن الخلية هي الوحدة الصغرى اللازمة للحياة كما نفهمها حاليا ذلك، مختلف الباحثين حاولوا بناء خلايا اصطناعية من بسيطة، المواد الكيميائية مفهومة جيدا بحيث الظواهر التي تحدث داخل هذه الخلايا الاصطناعية يمكن دراستها، مع الهدف النهائي المتمثل في توضيح أصل الحياة ودراسة وظائف أساسية من الخلايا الحية 1، 2، 3. على وجه الخصوص، حويصلات 4، والتي هي microcompartments كروية مصنوعة من جزيئات محبة للجهتين ويمكن تغليف الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات 5 و 6 و 7 الحمض النووي، 8، 9،معشوقة = "XREF"> 10، وغالبا ما تستخدم كنماذج من الأغشية البيولوجية.
ويمكن تصنيف حويصلات صغيرة (كما هو موضح التي يبلغ قطرها <100 نانومتر)، كبير (قطر <1 ميكرون)، أو العملاق (قطر> 1 ميكرون). وقد تم دراسة الحويصلات العملاقة (مشاهد عامة) على نطاق واسع لأنها تشبه الخلايا الحية في الحجم والشكل، وهيكل. ونظرا لحجم مشاهد عامة، تغيرات شكلية في الأغشية GV يمكن بسهولة أن يلاحظ في الوقت الحقيقي تحت المجهر الضوئي.
وقد ذكرت عدة طرق لإعداد مشاهد عامة 11، بما في ذلك طريقة ترطيب 12 و 13، وطريقة تجميد أذاب 14، وطريقة electroformation 15 و 16، وطريقة جهاز فلويديك 17 و 18. ومع ذلك، التغليف البروتينات وغيرها من macromolecules في مشاهد عامة بتركيزات عالية عن طريق هذه الأساليب أمر صعب. على وجه الخصوص، فمن صعبة للغاية لتغليف المواد البيولوجية بكميات كافية (20-30 المجلد٪) لمحاكاة بيئة مزدحمة داخل الخلايا 19، 20. لتشكيل مشاهد عامة على الفور، إنشاء ويتز وزملاء العمل على الماء في النفط (ث / س) طريقة مستحلب الطرد المركزي 21، 22. هذا الأسلوب لديه خمسة من الميزات الهامة. أولا، لأن مشاهد عامة من خلال هذه الطريقة التي أعدت لها أدنى lamellarity 23، 24، الأغشية رقيقة حتى أنها يمكن أن تكون مشوهة بسهولة. وقد تمت دراسة GV تشوه غشاء الناجم عن بروتين زد (بكتيري البروتين انقسام الخلايا)، تويولين، والجزيئات الأخرى 25، 26، 27، 28، ونحن لاحظ polyhe DRON مثل تشوه الأغشية GV الناجمة عن التغليف المجهرية 29، 30. ثانيا، يمكن إدراج البروتينات الغشاء في الغشاء الحويصلي بهذه الطريقة، ولو بصعوبة (31). على سبيل المثال، استخدمت مجموعة Yomo هذا الأسلوب لدراسة التركيب في المختبر ونشاط تشكيل المسام من البروتين غشاء α-دموية 32. ثالثا، فمن الممكن لتوليد مشاهد عامة غير المتماثلة التي مكونات الدهون من النشرات الداخلية والخارجية هي مختلفة 22. على سبيل المثال، Whittenton وآخرون. ولدت مشاهد عامة غير متكافئة مع الدهون الموجبة في النشرة الداخلية لتغليف عديد البيوكليوتيد سالبة الشحنة، ومع الدهون المحايدة على النشرة الخارجية لتقليل سمية وامتصاص الخلايا غير محددة 33. رابعا، التركيز وحجم جزء من المواد داخل مشاهد عامة يمكن أن تكون عالية نسبياالصورة = "XREF"> 28، 34. خامسا، أنواع متعددة من المواد يمكن أن تكون مغلفة 35. على سبيل المثال، نيشيمورا وآخرون. مغلفة في المختبر نظام النسخ الترجمة إلى مشاهد عامة واستخدام النظام للتعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ضمن مشاهد عامة 36. هذه الميزات خمسة تجعل ث / س مستحلب الطرد المركزي وسيلة لا غنى عنها لتوليد مشاهد عامة، ومحاكاة الخلية.
في الأعمال السابقة، جمعت مشاهد عامة الناتجة عن الطرد المركزي عن طريق حقنة مجهزة طويلة 16 G إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ التي تحتوي على بعض من محلول مائي النهائي 22. في أيدي فنيين عديم الخبرة، وهذا يمكن أن طريقة جمع تؤدي بسهولة في تلوث GV مع بعض الزيت. في هذه الدراسة، استخدمنا ث / س بروتوكول مستحلب الطرد المركزي التي وضعها الفريق Yomo 23، 37،حيث يتم جمع مشاهد عامة عجلت من خلال ثقب فتح في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي التي يتم إعدادها. ونحن على استعداد لقطات عامة التغليف 1.0 ميكرون المجهرية، التي تشبه في حجمها عضيات داخل الخلايا. استخدام المجهرية سمح لنا لتقدير تركيز من خلال حساب جزء حجمها. إنشاء وسيلة لإعداد مشاهد عامة التي هي معبأة المواد ذات الكثافة هي خطوة هامة لخلق خلايا اصطناعية. لتأكيد جدوى بروتوكول لدينا أنواع مختلفة من المواد الداخلية، وأثبتنا أيضا أن GFP وصغيرة للذوبان في الماء جزيء فلوري (uranine) يمكن أن تكون مغلفة في مشاهد عامة.
يجب أن يتم اختيار النوعي للالمائي الداخلي المتوسطة التشتت ومحلول مائي الخارجي بعناية. لث / س مستحلب ليعجل في محلول مائي الخارجي أثناء الطرد المركزي، يجب أن يكون الثقل النوعي للداخلية المتوسطة تشتت مائي أكبر من ذلك من محلول مائي الخارجي. حاولنا لإعداد مشاهد عامة باستخدام الحلول الداخلية والخارجية دون السكريات، ولكن حصلنا على أي مشاهد عامة في ظل هذه الظروف، لأن محلول مائي داخلي لم يكن لديها كتلة كافية لعبور التداخل بين المرحلتين. إذا كان هناك اختلاف الضغط الاسموزي كبير بين الحلين، مشاهد عامة أن يعجل في محلول مائي الخارجي قد يتقلص أو تمزق. لذلك، يجب أن يكون الضغط الاسموزي داخل وخارج مشاهد عامة المساواة. ولتحقيق ذلك، كنا السكروز كما المذاب في تشتت مائي داخلي والجلوكوز كما المذاب في محلول مائي الخارجي؛ وكانت كل من السكريات في نفس التركيز. كل من الملحSS = "XREF"> 22 والسكر 23، 35، 38 وقد استخدمت لهذا الغرض، ولكن تستخدم السكر عادة لأنه أقل سمية وأكثر قابلية للذوبان من الملح. ومع ذلك، إذا تم إضافة الكثير من السكر، قد حان لقطات عامة لفي اتصال مع الجزء السفلي من الزجاج غطاء والانهيار. هناك عدة استراتيجيات لتجنب هذا. استراتيجية واحدة هي لتقليص الفارق الثقل النوعي بين الحلول الداخلية والخارجية المائية بحيث مشاهد عامة تترسب تحت ظروف معتدلة. على وجه التحديد، وطاف تشتت GV عجلت يمكن تبادلها مع حل مطابق للمحلول مائي الداخلي للحد من إمكانية تمزق الحويصلي من الالتصاق على الزجاج غطاء نتيجة الطفو. استراتيجية أخرى هي precoat كلا من النظارات غطاء مع رقيقة الدهون فيلم 29.
الإعداد المناسب وحضانة مستحلب وأهمية. كنا البارافين السائل لإعداد الحل النفط. الزيوت المعدنية 26، 31، الدوديكان 21، 33، وsqualane 33 و 39 وأيضا كثيرا ما يستخدم الزيوت المذيبات. لأن هذه المواد تختلف في الثقل النوعي، اللزوجة، والتوتر السطحي، أعداد مختلفة من الحويصلات تشكل حتى عند استخدام ظروف الطرد المركزي نفسها 33. للحصول على الحويصلات مع خصائص الهدف، لا بد من تحسين جاذبيات واللزوجة من المحاليل المائية الداخلية والخارجية محددة فضلا عن إعداد acceleration.For الطرد المركزي للمرحلة النفط، يجب أن يحدث حضانة في درجة حرارة عالية وجافة البيئة مثل حاضنة أو ديهيدراتور. في هذه الدراسة، ونحن تسخين البارافين السائل إلى 80 درجة مئوية إلى حل تماما الدهون molecules.In بالإضافة إلى ذلك، ينبغي مستحلبتكون على استعداد فقط حسب الحاجة ويجب أن يخضع فورا إلى الطرد المركزي لأنه غير مستقر بعد إعدادها و ث / س قطرات تلتحم بسهولة مع بعضها البعض. مستحلب يمكن تحضير كميات كبيرة من صوتنة، vortexing ل، أو التنصت. ومع ذلك، باستخدام الخالط يسمح للتحضير السريع لكميات كبيرة من مستحلب وأسهل استحلاب في النفط مع اللزوجة العالية. ومن المهم أيضا أن الطبقات مستحلب على محلول مائي الخارجي بلطف وبسرعة ثم يبرد في 4 درجات مئوية. لاختصار الوقت بين استحلاب والطرد المركزي، ونظام محلول مائي النفط الخارجي يمكن prechilled قبل الطبقات مستحلب على ذلك، والنظام برمته ويمكن بعد ذلك طرد immediately.If كان التعكر الأبيض يبدو أسرع أو أبطأ من المعتاد، والميكانيكية الخالط يجب أن تشطف جيدا لإزالة المنظفات التنظيف. وبالإضافة إلى ذلك، قبل استحلاب، يجب أن يكون الحل النفط، محلول مائي داخلي، ومستحلب صeturned إلى درجة حرارة الغرفة.
تسارع الطرد المركزي السليم مهم أيضا. بواسطة الطرد المركزي في 18000 ز س، كنا قادرين على إعداد مشاهد عامة مع المواد الداخلية واحدة مغلفة في تركيز عال. عندما يطلب من تغليف المواد متعددة، فمن الأفضل للحد من تسارع الطرد المركزي. على سبيل المثال، وقد تحقق نظام تجميع الأكتين التغليف سبع مركبات مع الطرد المركزي في أقل من 350 غرام × 35. في الحالات التي الطرد المركزي غير مرغوب فيه، لقطات عامة يمكن الحصول عليها عن طريق ضبط تركيز السكر أو عجل مستحلب تحت تأثير كتلته الخاصة 38، 40، 41.
طريقة ذكرت هنا واثنين من القيود الرئيسية. واحد هو أن جزيئات النفط (البارافين، في هذه الحالة) يمكن أن تذوب في غشاء GV، كما أشار إلى ذلك Weitض مجموعة 21. عندما يكون المطلوب الإدراج من بروتين الغشاء في غشاء GV، يجب النظر في آثار جزيئات النفط تتعايش على البروتين. الحد الآخر هو اختلاف حجم الكسر. في هذه الدراسة، قدرنا أن الكسور حجم المجهرية في مشاهد عامة تراوحت 4-30 المجلد٪، وكانت الكسور حجم يست متطابقة إلى نسبة حجم من محلول مائي الداخلي المستخدمة لإعداد GV. على الرغم من أننا كنا قادرين على تغليف المجهرية في مشاهد عامة في جزء حجم عالية بما فيه الكفاية لمراقبة المجهر، وهذه الطريقة ليست مناسبة لإعداد مشاهد عامة مع توزيع جزء حجم موحد. وقد أفيد أن توزيع microsphere حجم كسور يتغير أثناء الطرد المركزي 34.
يتم استخدام ث / س طريقة مستحلب الطرد المركزي عادة لتشكيل مشاهد عامة تحتوي على مواد مغلفة. ومع ذلك، فقد وصفت بعض التقارير عجبر مشاهد عامة التغليف المواد الميكروسكيل 34، 42. مؤخرا، تم بناء الروبوتات الجزيئية التي تحتوي على جهاز الحمض النووي مغلفة أو جهاز الجزيئي 43 و 44. مشاهد عامة مع مقصورات هي الخيار الأول لهذه الأنواع من التطبيقات؛ وبالتالي، التقنيات، مثل بلدنا، التي يمكن أن تستخدم لتغليف المجهرية المغناطيسية والمجهرية مع functionalization سطح متنوعة من المتوقع أن يكون مفيدا 44.
The authors have nothing to disclose.
نشكر توموكو ياماغوتشي لرسم صورة تخطيطية في الشكل 1. وأيد هذه الدراسة من قبل مشروع أوكازاكي ORION معهد أوكازاكي التكاملي العلوم البيولوجية من ذي جلف توداي معاهد العلوم الطبيعية (NINS)؛ من مشروع مركز البيولوجيا الفلكية (لا AB281010.) من NINS. بواسطة منحة في والمساعدات للبحوث العلمية في المجالات المبتكرة (ترتيب الديناميكية للنظم البيولوجية الجزيئية لخلق وظائف متكاملة) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (بدون 25102008)؛ بواسطة منحة في والمساعدات للعلماء الشباب (ب) (لKK، لا 15K17850.) من JSPS. andby منحة في والمساعدات للبحوث آخر للبدء في إنشاء (لYN، لا. 15H06653) من JSPS. وقدم دعم إضافي من خلال منحة من معهد نوغوشي، منحة من مؤسسة كاو للفنون والعلوم، ومنحة من المياه KURITA ومؤسسة البيئة.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |