Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
建设性生物学和合成生物学的方法来创建人工生命涉及生物或非生物材料的自下而上装配。这种方法已经得到极大的重视科研的生活和非生命物质的之间的边界上,并已使用在过去的二十年里建造人造细胞。特别是,巨人囊泡(GVS)经常被用作人造细胞膜。在本文中,我们将介绍GVS封装高度封装的微球含有高度浓缩生物分子的细胞模型的准备。在GVS通过一个简单的水包油乳剂离心法的方法制备。具体地,均化器,使用乳化含有待包封的材料的水溶液与含有溶解的磷脂的油,将得到的乳液的另一种水溶液的表面上小心分层。然后分层系统离心ŤØ生成GVS。采用这种强大的方法来封装不等的小分子微球材料。
建设性,或合成的,生物学的方法是探索生活之间的边界和非生命物质的一个迷人的途径。因为该细胞是生命所需要的最小单位,因为我们目前所知,各种研究人员试图构造简单,易于理解的化学物质的人造细胞,使这种人工细胞中发生的现象,可以研究,以阐明的最终目标生命的起源和研究活细胞1,2,3的基本功能。特别是,小泡4,它是制成两性分子球形微区和可以封装生物分子如蛋白质5,6和DNA 7,8,9,小姑娘=“外部参照”> 10,经常被用来作为生物膜的模型。
囊泡可以被分类为小(定义为具有直径<100nm的),大(直径<1微米),或巨(直径> 1微米)。巨囊泡(GVS),因为它们类似于活细胞的大小,形状和结构已被广泛研究。由于GVS的大小,在GV膜的形态学变化可以很容易地进行实时的光学显微镜下观察。
制备GVS几种方法已经报道了11,包括水合方法12,13中 ,冻融法14,electroformation方法15,16和流体装置的方法17,18。然而,包封蛋白质和其它MACROM通过这些方法的装置在GVS olecules在高浓度是困难的。尤其是,它是非常具有挑战性的封装在足够量(20-30体积%)的生物材料,以模仿细胞内部19,20中的拥挤的环境。为形成GVS瞬间,韦茨和他的同事建立了一个水包油(W / O)乳液离心法21,22。这种方法有五个重要的特性。首先,因为用这种方法制备GVS具有低层数23,24,它们的膜是如此之薄,他们可以很容易地变形。由的FtsZ(细菌细胞分裂的蛋白质),微管蛋白,和其它大分子诱导GV膜变形已经研究25,26,27,28,和我们观察polyhe通过微球29,30的封装诱导GV膜德龙状变形。第二,膜蛋白可以插入通过这种方法,小泡膜尽管有困难31。例如,YOMO组使用这种方法来研究膜蛋白α溶血素32的体外合成和孔形成活性。第三,有可能产生非对称GVS,其中内和外小叶的脂质组分是不同的22。例如,Whittenton 等。与内小叶来封装带负电荷的多核苷酸的阳离子脂质,并与外部小叶中性脂质产生不对称GVS降低毒性和非特异性细胞摄取33。第四,物质的GVS内的浓度和体积分数可以是相对高的S =“外部参照”> 28,34。第五,多种类型的材料可封装35。例如,Nishimura 等人的封装体外转录-翻译系统进入GVS和所使用的系统的GVS 36内表达绿色荧光蛋白(GFP)。这五个特点使W / O乳化离心产生细胞模仿GVS不可缺少的方法。
在先前的工作中,通过离心分离生成的GVS通过装有用含一些最终水溶液22的长为16G的不锈钢针注射器装置收集。在经验的技术人员手中,这种收集方法很容易导致一些油的GV的污染。在这项研究中,我们使用由YOMO组23,37开发的w / o乳液离心协议其中,通过在离心管中,他们制备的底部上的孔打开沉淀GVS被收集。我们制备GVS包封1.0微米的微球,其在尺寸上与细胞内细胞器相似。使用的微球的允许我们通过计算它们的体积分数来估计其浓度。准备GVS,其中材料被密密麻麻方法的建立是创造人造细胞的重要一步。为了证实我们的各类内的材料的协议的效用,我们还证明了GFP和一个小的水溶性荧光分子(荧光素钠)可在GVS进行封装。
内部水分散介质和外侧水溶液的比重必须仔细选择。为w / o乳液,以沉淀成在进行离心处理期间外水溶液,内部水分散介质的比重必须比外水溶液大。我们试图制备使用内和外解决方案,而糖GVS,但我们得到的这些条件下没有GVS,因为内水溶液没有足够的质量,以跨越两相之间的干扰。如果有上述两种溶液,GVS该沉淀入外水溶液可以收缩或破裂之间的大的渗透压差。因此,内,外GVS渗透压必须相等。要做到这一点,我们使用蔗糖作为在内部水分散体和葡萄糖作为在外层水溶液溶质溶质;两个糖是在相同的浓度。这两种盐SS =“外部参照”> 22和糖23,35,38已被用于这种目的,但通常使用的糖,因为它是毒性更小,比盐更可溶。然而,如果加入过多的糖,则GVS会与玻璃盖和崩溃的底部接触。有避免这几款策略。一种策略是降低内,外的水溶液,使得GVS温和条件下沉淀之间的比重差;具体地,沉淀的GV分散液的上清液可以用一个解决方案是相同的内水溶液通过粘接,以减少对盖玻璃作为浮力的结果囊泡破裂的可能性进行交换。另一种策略是用脂质薄膜29预涂两个盖玻片。
适当的准备和孵化乳液都重要。我们使用的液体石蜡来制备油溶液。矿物油26,31,十二烷21,33,和角鲨烷33,39也经常用作溶剂油。因为这些材料的比重,粘度和表面张力而变化,囊泡不同数量时相同的离心条件使用33甚至形成。以获得具有目标性能的囊泡,它是必不可少的,以优化比重和内外水溶液粘度以及油相的离心acceleration.For制备,孵育必须发生在高温下,在干燥环境如培养箱或脱水。在这项研究中,我们加热液体石蜡至80℃以完全溶解脂质molecules.In此外,乳剂应根据需要,应立即进行离心,因为它是不稳定的是制备后立即和仅制备的W / O型微滴容易熔合到彼此。该乳液可大量通过超声处理,涡旋,或攻丝来制备。然而,使用均化器允许大量乳液的快速制备和更容易乳化油具有高的粘度。同样重要的是,该乳液的外水溶液轻轻和迅速,然后在4℃冷却分层。缩短乳化和离心之间的时间,油外水溶液系统可以将乳液在其上层叠之前预冷,并immediately.If白浊出现比平常更快或更慢,机械整个系统然后可以离心均质必须进行彻底漂洗,以除去清洁剂。此外,乳化之前,油溶液,内水溶液和乳化剂必须为returned至室温。
适当的离心加速度也很重要。通过18000×g下离心,我们能够以高浓度包封单个内部材料制备GVS。当需要多种材料的封装,最好是减小离心加速度。例如,肌动蛋白组装系统包封个化合物,用离心低于350×g的35来实现的。在其离心是不希望的情况下,GVS可以通过调节糖浓度或通过其自身质量38,40,41的作用下沉淀该乳液得到。
本文所报导的方法有两个主要的限制。其中之一是,油分子(石蜡,在这种情况下)可以在GV膜被溶解,如已经指出的WEITZ基团21。当膜蛋白进入GV膜的插入是期望的,在蛋白质上共存的油分子的影响必须考虑。另一限制是体积分数的变化。在这项研究中,我们估计,微球在GVS的体积分数从4-30体积%范围;的体积分数不是完全相同用于GV制备的内水溶液的体积分数。虽然,我们能够在一个体积分数为显微镜观察高到足以封装在GVS微球,这种方法是不适合于制备GVS的具有均匀体积分数分布。已经报道了微球的体积分数的分布离心34期间变化。
在w / o乳液离心法通常用于含有包封材料GVS的形成。然而,很少有报道描述为PGVS微型封装材料34,42的赔偿。近日,包含封装器件的DNA或分子器件的分子机器人已建成43,44。与车厢GVS是这类应用的首选;因此,技术,如我们的,这可用于包封的磁性微球和微球与不同的表面官能可以预期是有用的44。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢山口智子在图1绘制了示意图像。这项研究是由冈崎研究所自然科学theNational学院生物科学结合的冈崎ORION项目(NINS)的支持;由天体生物学中心项目NINS(无AB281010);由格兰特 – 在援助来自日本学术振兴科学研究的创新领域(用于创建集成功能生物分子系统的动态排序)(JSPS)(无25102008);由格兰特 – 在资助青年科学家(B)(以KK,没有15K17850)由日本学术振兴会; andby从JSPS格兰特 – 在援助研究活动启动(以YN,没有。15H06653)。额外的支持是由野口研究所,花王基金会艺术和科学的资助,并从栗田与环境基金会的资助拨款提供。
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |