Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
Конструктивный биология и синтетической биологии подход к созданию искусственной жизни включать снизу вверх сборку биологических или небиологических материалов. Такие подходы получили значительное внимание в исследованиях на границе между живой и неживой материей и были использованы для создания искусственных клеток в течение последних двух десятилетий. В частности, гигантский везикулы (GVs) часто использовались в качестве искусственных клеточных мембран. В этой статье мы опишем подготовку GvS заключающих высоко упакованных микросферы в качестве модели клеток, содержащих конденсированные высоко биомолекул. В GVs были получены с помощью простого метода эмульсии центрифугирования вода-в-масле. В частности, гомогенизатор использовался для эмульгирования водного раствора, содержащего материалы для инкапсулирования и масло, содержащее растворенные фосфолипиды, и полученную эмульсию осторожно наслаивают на поверхность другого водного раствора. Слоистая система затем центрифугировали то генерации GvS. Этот мощный метод был использован для инкапсулирования материалов, начиная от небольших молекул микросферы.
Конструктивная, или синтетический, биологический подход является увлекательным направлением для изучения границы между живой и неживой материи. Поскольку клетка является минимальной единицей, необходимое для жизни, как мы сейчас понимаем, различные исследователи попытались построить искусственные клетки из простых, хорошо понятных химических веществ, так что явления, которые происходят в таких искусственных клеток могут быть изучены, с конечной целью выяснении происхождение жизни и изучение основных функций живых клеток 1, 2, 3. В частности, везикулы 4, которые представляют собой сферические microcompartments из амфифильных молекул и могут инкапсулировать биологические молекулы , такие как белки 5, 6 и 7 , ДНК, 8, 9,деваха = "Xref"> 10, часто использовались в качестве моделей биологических мембран.
Пузырьки могут быть классифицированы как малые (определенный как имеющий диаметр <100 нм), крупные (диаметром <1 мкм) или гигантской (диаметр> 1 мкм). Гигантские везикулы (GvS) были изучены, потому что они похожи на живые клетки, по размеру, форме и структуре. Вследствие размера GvS, морфологические изменения в мембранах GV легко можно наблюдать в реальном времени под оптическим микроскопом.
Известно несколько способов приготовления GvS поступало 11, в том числе метод гидратной 12, 13, методом замораживания-оттаивания 14, метод electroformation 15, 16, и способ струйного устройства 17, 18. Тем не менее, инкапсулирующие белки и другие MACROMolecules в GvS при высоких концентрациях с помощью этих методов трудно. В частности, чрезвычайно сложной задачей , чтобы инкапсулировать биологические материалы в достаточном количестве (20-30% по объему) , чтобы имитировать переполненной среды внутри клеток 19, 20. Для формирования GVs мгновенно, Вайц и его коллеги установили вода-в-масле ( в / м) методом центрифугирования эмульсии 21, 22. Этот метод имеет пять важных особенностей. Во- первых, потому , что GVs , приготовленные этим способом , имеют низкую ламеллярности 23, 24, их мембраны являются настолько тонкими , что они могут быть легко деформируется. Г.В. деформации мембраны , индуцированное FtsZ (белок бактериальной клетки деление), тубулина и других макромолекул было изучено 25, 26, 27, 28, и мы наблюдали polyhe ДРОН-как деформация GV мембран , индуцированных инкапсулирования микросфер 29, 30. Во- вторых, мембранные белки могут быть вставлены в везикулярного мембрану с помощью этого метода, хотя и с трудом 31. Например, группа Yomo использовали этот метод для изучения синтеза в лабораторных условиях и порообразующего активность мембранного белка альфа-гемолизина 32. В- третьих, можно генерировать асимметричные GvS , в которых липидные компоненты внутреннего и наружного листков различны 22. Например, Whittenton и др. генерируемые асимметричные GVs с катионными липидами во внутреннем листке инкапсулировать отрицательно заряженные полинуклеотиды, и с нейтральными липидами на внешней листка , чтобы уменьшить токсичность и неспецифическую клеточного поглощения 33. В-четвертых, концентрация и объемная доля веществ внутри GvS может быть относительно высокимs = "Xref"> 28, 34. В- пятых, несколько типов материалов могут быть инкапсулированы 35. Например, Нисимура и др. инкапсулированные системы транскрипции-трансляции в пробирке в GvS и использовали систему для выражения зеленого флуоресцентного белка (GFP) в пределах GvS 36. Эти пять функций делают без эмульсии центрифугирования незаменимым методом для создания клеточных имитирующие GvS.
В предыдущей работе, GVs , сгенерированные с помощью центрифугирования собирали с помощью шприца , оборудованного длинной 16 G из нержавеющей стали иглы , содержащей некоторые из окончательного водного раствора 22. В руках неопытного техников, этот метод сбора может легко привести к загрязнению GV с некоторыми из нефти. В данном исследовании мы использовали протокол эмульсии центрифугирование з / о , разработанный группой Yomo 23, 37,в котором собраны осажденные GVs через отверстие открыто в нижней части трубки центрифуги, в которых их получают. Мы подготовили GvS инкапсулирующие 1,0 мкм микросферы, которые близки по размерам к внутриклеточных органелл. Использование микросферы позволило оценить их концентрацию путем расчета их объемной доли. Создание метода для получения GvS, в котором материалы плотно упакованы, является важным шагом для создания искусственных клеток. Для подтверждения полезности предлагаемого протокола для различных типов внутренних материалов, мы также показали, что GFP и небольшой водорастворимое флуоресцентное молекула (uranine) может быть воплощен в GvS.
Удельные массы внутренней водной дисперсионной среде и к внешней водного раствора должна быть тщательно подобраны. Для ж / м эмульсии для осаждения в наружный водный раствор во время центрифугирования, удельный вес внутренней водной дисперсионной среды должна быть больше, чем у наружного водного раствора. Мы попытались подготовить GvS, используя внутренние и внешние решения без сахара, но мы не получали ни одного GvS в этих условиях, потому что внутренний водный раствор не имеет достаточную массу, чтобы пересечь помех между двумя фазами. Если есть большая разница осмотического давления между двумя решениями, GvS, которые осаждаются в наружный водный раствор может сжиматься или разрыва. Таким образом, осмотическое давление внутри и снаружи GvS должны быть равны. Для достижения этой цели мы использовали сахарозу в качестве растворенного вещества во внутренней водной дисперсии и глюкозы в качестве растворенного вещества во внешнем водном растворе; оба сахара были в той же концентрации. Обе солисс = "Xref"> 22 и сахара 23, 35, 38 используются для таких целей, но сахар обычно используется , потому что он менее токсичен и более растворимы , чем соли. Тем не менее, если добавляется слишком много сахара, то GVs могут вступать в контакт с нижней части покровного стекла и коллапс. Есть несколько стратегий для предотвращения этого. Одна из стратегий заключается в снижении специфической разности плотности между внутренним и наружным водных растворов так, чтобы GVs осаждаются в мягких условиях; В частности, супернатант осаждали дисперсии Г.В. может быть обменена с раствором, который идентичен внутреннему водному раствору, чтобы уменьшить вероятность разрыва везикулярного адгезией к покровным стеклом в результате плавучести. Другая стратегия заключается в намывных оба покровных стекол с тонкой липидной пленки 29.
Правильная подготовка и инкубация эмульсииважный. Мы использовали жидкий парафин для приготовления раствора масла. Минеральное масло 26, 31, додекан 21, 33, и сквалан 33, 39 также часто используют в качестве растворителей , масел. Поскольку эти материалы различаются по удельному весу, вязкости и поверхностного натяжения, различные числа везикул образуют даже тогда , когда одни и те же условия центрифугирования используются 33. Для получения везикул с целевыми свойствами, важно, чтобы оптимизировать Удельные и вязкостей внутренних и внешних водных растворов, а также центробежный препарат acceleration.For масляной фазы, инкубация должна происходить при высокой температуре и в сухом среда, таких как инкубатор или водоотделитель. В этом исследовании мы нагревали жидкого парафина до 80 ° С до полного растворения липидов molecules.In Кроме того, эмульсия должнабыть подготовлены только по мере необходимости, и должны быть немедленно центрифугировали, поскольку она нестабильна только после того, как он подготовлен и без капельки легко сливаться друг с другом. Эмульсия может быть получен в больших количествах путем обработки ультразвуком, встряхивания или накладкой. Тем не менее, с помощью гомогенизатора позволяет быстрого приготовления больших количеств эмульсии и более легкого эмульгирования в масле с высокой вязкостью. Кроме того, важно, чтобы эмульсия наслаивать на внешнем водном растворе осторожно и быстро, а затем охлаждали при 4 ° С. Для того, чтобы сократить время между эмульгирования и центрифугирования, водная система масляного раствора аута может быть prechilled до того, как эмульсия наслаивается на него, и вся система может быть затем центрифугируют immediately.If белый мутность появляется быстрее или медленнее, чем обычно, механическая гомогенизатор необходимо тщательно промыть, чтобы удалить моющие средства. Кроме того, перед эмульгированием, масляный раствор, внутренний водный раствор, и эмульгатор должен быть гeturned до комнатной температуры.
Правильное центробежное ускорение также имеет важное значение. Центрифугированием при 18000 х г, мы смогли подготовить GvS с одним внутренним материалом , инкапсулированного в высокой концентрации. Когда требуется инкапсуляция нескольких материалов, то лучше уменьшить центробежное ускорение. Например, система актина сборки капсулирования семь соединений достигалось с центрифугированием при менее 350 х г в 35. В тех случаях , в которых центрифугирование нежелательно, GVs может быть получено путем изменения концентрации сахара или путем осаждения эмульсии под действием собственной массы 38, 40, 41.
Метод сообщаемые здесь имеет два основных ограничения. Одним из них является, что молекулы масла (парафин, в данном случае) могут быть растворены в мембране GV, как уже было отмечено, на Weitг группы 21. Когда вставка мембранного белка в мембрану GV желательно, то необходимо учитывать эффекты сосуществующих молекул масла на белке. Другим ограничением является изменение объемной доли. В этом исследовании мы оценили, что объемные доли микросфер в GvS варьировались от 4-30% по объему; объемные доли не были идентичны объемной доли внутреннего водного раствора, используемого для приготовления GV. Несмотря на то, что мы были в состоянии инкапсулировать микросферы в GvS при объемной доле, достаточно высокой для наблюдения микроскопии, этот способ не подходит для приготовления GvS с равномерным распределением объемной доли. Сообщалось , что распределение объемной доли микросфер изменяется во время центрифугирования 34.
W / O методом эмульсионной центрифугирование обычно используется для формирования GvS содержащих инкапсулированные материалы. Тем не менее, несколько сообщений описали ррепарации GvS заключающих Microscale материалы 34, 42. В последнее время , молекулярные роботы , содержащие инкапсулированный устройство ДНК или молекулярный устройство было построено 43, 44. GVs с отделениями являются первым выбором для такого рода приложений; Поэтому, методы, такие , как наша, которые могут быть использованы для инкапсулирования магнитных микросфер и микросферы с разнообразной функционализации поверхности можно ожидать , чтобы быть полезным 44.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Томоко Ямагучи для рисования схематическое изображение на рисунке 1. Это исследование было поддержано Окадзаки ORION Проекта Окадзаки Института интегративной Bioscience из theNational институтов естественных наук (NINS); в центре проекта астробиологии (без AB281010.) из NINS; по дотация для научных исследований по инновационным районам (динамическим упорядочением биомолекулярных систем для создания интегрированных функций) из Японского общества содействия развитию науки (JSPS) (без 25102008.); грантом-в-помощь для молодых ученых (B) (до KK, не 15K17850.) от JSPS; andby грантом-в-помощь для научно-исследовательской деятельности Start-Up (для YN, нет. 15H06653) от JSPS. Дополнительная поддержка была оказана за счет гранта от Ногучи института, грант от Kao фонда искусств и наук, а также грант от Куриты воды и Фонда окружающей среды.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |