Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
Die konstruktive Biologie und der synthetischen Biologie Ansatz künstliches Leben zu schaffen beinhalten die Bottom-up-Montage von biologischen oder nicht-biologische Materialien. Solche Ansätze haben erhebliche Aufmerksamkeit in der Forschung an der Grenze zwischen lebenden und nicht lebenden Materie erhalten und verwendet wurden, künstliche Zellen in den letzten zwei Jahrzehnten zu konstruieren. Insbesondere Riesenvesikeln (GVS) wurden oft als künstliche Zellmembranen verwendet worden. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von GVS hoch gepackt Mikrokügelchen als ein Modell der Zellen Einkapseln hochkondensierter Biomoleküle enthalten. Die GVs wurden mittels eines einfachen Wasser-in-Öl-Emulsion Zentrifugationsverfahren hergestellt. Insbesondere wurde ein Homogenisator verwendet, um eine wässrige Lösung zu emulgieren, die Materialien enthält, eingekapselt werden, und ein Öl gelöst Phospholipide enthält, und die resultierende Emulsion wurde vorsichtig auf die Oberfläche einer anderen wässrigen Lösung geschichtet. Das Schichtsystem wurde dann t zentrifugierto erzeugen die GVs. Diese leistungsstarke Methode wurde verwendet, Materialien zum Einkapseln von kleinen Molekülen zu Mikrokügelchen reichen.
Die konstruktive, oder synthetisch, ist biologischer Ansatz eine faszinierende Weg für die Grenze zwischen Leben erforschen und Materie nonliving. Da die Zelle ist die kleinste Einheit für das Leben benötigt, wie wir es derzeit verstehen, haben verschiedene Forscher versucht, künstliche Zellen von einfachen konstruieren, gut verstanden Chemikalien so dass Phänomene, die innerhalb eines solchen künstlichen Zellen auftreten können, untersucht werden, mit dem Ziel der Aufklärung die Entstehung des Lebens und die grundlegenden Funktionen von lebenden Zellen zu studieren 1, 2, 3. Insbesondere Vesikel 4, das sind sphärische Mikrokammern von amphiphilen Molekülen und 5 biologische Moleküle wie Proteine einkapseln kann, 6 und DNA 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, oft als Modelle von biologischen Membranen verwendet worden.
Vesikeln kann so klein eingestuft werden (definiert als mit einem Durchmesser von <100 nm), groß (Durchmesser <1 & mgr; m) oder Riesen (Durchmesser> 1 & mgr; m). Riesenvesikeln (GVS) wurden intensiv untersucht, da sie ähnlich zu den Zellen in Größe, Form und Struktur zu leben. Aufgrund der Größe der GVS, morphologischen Veränderungen in GV Membranen können leicht in Echtzeit unter einem optischen Mikroskop beobachtet werden.
Mehrere Verfahren zur Herstellung GVs wurden 11 berichtet worden, einschließlich der Hydratation Verfahren 12, 13, die Gefrier-Auftau – Verfahrens 14 wird die Elektroformation Verfahren 15, 16 und der Fluidikvorrichtung Verfahren 17, 18. Jedoch Proteine und andere MACROM Einkapselnolecules in GVs bei hohen Konzentrationen mit Hilfe dieser Verfahren schwierig ist. Insbesondere ist es extrem schwierig biologischen Materialien in ausreichender Menge (20-30 Vol-%) zu kapseln die gedrängten Umgebung innerhalb der Zellen 20 19, zu imitieren. Zur Bildung von GVs sofort, Weitz und Mitarbeiter eine Wasser-in-Öl etabliert (w / o) Emulsion Zentrifugationsmethode 21, 22. Diese Methode hat fünf wichtige Merkmale. Erstens, weil GVs nach diesem Verfahren hergestellte Nieder Lamellarität haben 23, 24, deren Membranen sind so dünn , daß sie leicht deformiert werden kann. GV Membranverformung durch FtsZ (a bakteriellen Zellteilung Protein), Tubulin induziert und anderen Makromolekülen wurde untersucht 25, 26, 27, 28, und wir beobachteten polyhe Eders artige Verformung von GV – Membranen durch Verkapselung von Mikrokugeln 29 induziert, 30. Zweitens können Membranproteine in die Vesikelmembran durch dieses Verfahren eingeführt werden, wenn auch mit Schwierigkeiten 31. Zum Beispiel verwendet die Yomo Gruppe dieser Methode die in vitro – Synthese und porenbildenden Aktivität des Membran – Protein α-Hämolysin – 32 zu studieren. Drittens ist es möglich , asymmetrische GVs zu erzeugen , in der die Lipidkomponenten der inneren und äußeren Blättchen verschiedenen 22 sind. Zum Beispiel Whittenton et al. erzeugten asymmetrischen GVs mit kationischen Lipiden in dem inneren Blatt negativ geladene Polynukleotide zu kapseln und mit neutralen Lipiden auf der äußeren Packungsbeilage 33 Toxizität und unspezifische zelluläre Aufnahme zu verringern. Viertens kann die Konzentration und der Volumenanteil der Substanzen innerhalb der GVs relativ hohens = "xref"> 28, 34. Fünftens können mehrere Arten von Materialien eingekapselt 35 werden. Zum Beispiel Nishimura et al. ein in vitro Transkriptions-Translations – System in GVs gekapselt und verwendet , um das System grün fluoreszierendes Protein (GFP) innerhalb des GVs 36 auszudrücken. Diese fünf Eigenschaften machen w / o Emulsion Zentrifugation ein unverzichtbares Verfahren zur Erzeugung von zell nachahmt GVs.
In früheren Arbeiten, durch Zentrifugieren erzeugt GVs wurden mittels einer Spritze gesammelt , ausgestattet mit einer langen 16 G Nadel aus rostfreiem Stahl einige der fertigen wässrigen Lösung , die 22. In den Händen von unerfahrenen Techniker, könnte diese Sammlung Verfahren leicht zu einer Kontamination des GV mit etwas Öl. In dieser Studie verwendeten wir die w / o Emulsion Zentrifugationsprotokoll von der Gruppe Yomo entwickelt 23, 37,in dem ausgefällten GVs werden gesammelt durch ein Loch am Boden des Zentrifugenröhrchens geöffnet, in dem sie hergestellt werden. Wir bereiteten GVs Einkapseln 1,0 um Mikrokugeln, die in der Größe zu intrazellulären Organellen sind ähnlich. Die Verwendung von Mikrokügelchen erlaubt uns ihre Konzentration zu schätzen, indem ihr Volumenanteil berechnet wird. Etablierung eines Verfahrens zur Herstellung von GVs, in denen Materialien dicht gepackt sind, ist ein wichtiger Schritt für die künstliche Zellen zu schaffen. Um die Nützlichkeit unseres Protokoll für verschiedene Arten von Innenmaterialien bestätigen wir auch gezeigt, dass GFP und ein kleines wasserlösliches fluoreszierendes Molekül (Uranin) könnte in den GVs verkapselt werden.
Die spezifischen Gewichte der inneren wässrigen Dispersionsmediums und der äußeren wässrigen Lösung muss sorgfältig ausgewählt werden. Für die W / O-Emulsion in die äußere wäßrige Lösung während der Zentrifugation auszufällen, muß das spezifische Gewicht der inneren wässrigen Dispersionsmediums größer als die der äußeren wässrigen Lösung. Wir haben versucht, unter Verwendung GVs inneren und äußeren Lösungen ohne Zucker herzustellen, aber wir erhalten keine GVs unter diesen Bedingungen, da die innere wässrige Lösung nicht genug Masse haben, hat die Interferenz zwischen den beiden Phasen zu überqueren. Wenn es eine große osmotische Druckdifferenz zwischen den beiden Lösungen, GVs, die in die äußere wässrige Lösung ausfallen kann oder Ruptur schrumpfen. Daher muß der osmotische Druck innerhalb und außerhalb der GVs gleich sein. Um dies zu erreichen, verwendet man Saccharose als ein gelöster Stoff in der inneren wässrigen Dispersion und Glucose als ein gelöster Stoff in der äußeren wßrigen Lösung; beide Zucker wurden bei der gleichen Konzentration. Beide Salz23 ss = "Xref"> 22 und Zucker, 35, 38 wurden für solche Zwecke verwendet wird , sondern Zucker wird normalerweise verwendet , da es weniger toxisch ist und löslicher als Salz. wenn zu viel Zucker ist jedoch hinzugefügt, können die GVs in Kontakt mit der Unterseite des Deckglases und Zusammenbruch. Es gibt verschiedene Strategien dies zu vermeiden. Eine Strategie ist es, die spezifische Dichte Differenz zwischen den inneren und äußeren wässrigen Lösungen zu reduzieren, so dass die GVs unter milden Bedingungen auszufällen; Insbesondere kann der Überstand der ausgefällten GV Dispersion mit einer Lösung ausgetauscht werden, die auf der inneren wässrigen Lösung identisch ist, die Möglichkeit des vesikulären Ruptur durch Haftung auf dem Deckglas infolge des Auftriebs zu reduzieren. Eine andere Strategie ist mit einer dünnen Lipidfilm 29 beide Deckgläser vorbeschichtet.
Die richtige Vorbereitung und Inkubation der Emulsionwichtig. Wir verwendeten Paraffinöl, das Öl-Lösung herzustellen. Mineralöl 26, 31, Dodecan 21, 33 und Squalan 33, 39 werden verwendet , oft auch als Lösungsmittel Öle. Da diese Materialien in spezifischen Gewicht variieren, Viskosität und Oberflächenspannung, eine unterschiedliche Anzahl von Vesikeln bilden , selbst wenn die gleiche Zentrifugationsbedingungen 33 verwendet werden. Um die Vesikel mit den Zieleigenschaften zu erhalten, ist es wichtig, die spezifische Dichten und Viskositäten der inneren und äußeren wässrigen Lösungen sowie die zentrifugale acceleration.For Herstellung der Ölphase zu optimieren, muss der Inkubation bei hoher Temperatur auftreten und in einem trockenen Umgebung wie einem Inkubator oder einem Dehydrator. In dieser Studie erhitzt man das flüssige Paraffin auf 80 ° C vollständig das Lipid zusätzlich molecules.In aufzulösen, sollte die Emulsionnur hergestellt werden, wie erforderlich und sollte sofort zentrifugiert werden, da es instabil ist nur, nachdem es hergestellt wird, und die w / o leicht Tröpfchen miteinander verschmelzen. Die Emulsion kann in großen Mengen durch Beschallung, Verwirbelung oder Anzapfung hergestellt werden. Jedoch erlaubt mit einer hohen Viskosität zur schnellen Herstellung von großen Mengen an Emulsion und einfacher Emulgierung in Öl unter Verwendung eines Homogenisators. Es ist auch wichtig, daß die Emulsion auf der äußeren wässrigen Lösung sanft und schnell und dann bei 4 ° C gekühlt geschichtet werden. Um die Zeit zwischen Emulgierung und Zentrifugieren der öl äußeren wäßrigen Lösungssystem verkürzen kann vorgekühlt werden, bevor die Emulsion auf ihm überlagert wird, und das ganze System kann dann zentrifugiert werden immediately.If die weiße Trübung erscheint schneller oder langsamer als üblich, das mechanische Homogenisator gründlich Reinigungsmittel zu entfernen gespült werden. Darüber hinaus vor der Emulgierung die Öllösung, innere wässrige Lösung und Emulgator muß r seineturned auf Raumtemperatur.
Proper Zentrifugalbeschleunigung ist ebenfalls wichtig. Durch Zentrifugieren bei 18.000 x g, konnten wir GVs mit einem einzigen Innenmaterial in einer hohen Konzentration eingekapselt vorzubereiten. Wenn die Einkapselung mehrerer Materialien erforderlich ist, ist es besser, die Zentrifugalbeschleunigung zu reduzieren. Zum Beispiel wurde mit Zentrifugation ein Aktin – Zusammensetzungs – System sieben Verbindungen einkapseln bei weniger als 350 x g 35 erzielt. In Fällen , in denen Zentrifugation unerwünscht ist, kann GVs durch Einstellen der Zuckerkonzentration oder durch Ausfällen der Emulsion unter dem Einfluß seiner eigenen Masse 38, 40, 41 erhalten werden.
Das Verfahren berichtet hier hat zwei wesentliche Einschränkungen. Einer ist, dass Ölmoleküle (Paraffin, in diesem Fall) in der GV-Membran löslich gemacht werden, wie dies durch die Weit hingewiesenz Gruppe 21. Beim Einführen eines Membranproteins in die GV-Membran gewünscht wird, müssen die Auswirkungen der koexistierenden Ölmoleküle auf dem Protein betrachtet werden. Die andere Einschränkung ist die Variation der Volumenanteil. In dieser Studie schätzt man, dass die Volumenanteile der Mikrokugeln in den GVs 4-30 Vol-% lag; die Volumenanteile wurden zu dem Volumenanteil der inneren wässrigen Lösung zur Zubereitung verwendet GV nicht identisch. Obwohl wir in der Lage waren Mikrokugeln in den GVs bei einer ausreichend hohen Volumenanteil für die Mikroskopie Beobachtung zu kapseln, ist dieses Verfahren zur Herstellung von GVs mit einer gleichmäßigen Volumenanteil Verteilung nicht geeignet. Es wurde berichtet, dass die Verteilung der Mikrokügelchen Volumenanteile verändert während der Zentrifugation 34.
Die w / o-Emulsion Zentrifugationsverfahren wird für die Bildung von GVs enthält eingekapselten Materialien verwendet. Allerdings haben nur wenige Berichte, die p beschriebenReparatur von GVs Einkapseln mikroskaligen Materialien 34, 42. Vor kurzem molekulare Roboter eine verkapselte DNA – Gerät oder ein Molekular Gerät wurden 43 enthält , konstruiert, 44. GVs mit Fächern sind die erste Wahl für diese Art von Anwendungen; deshalb Techniken, wie unsere, die zum Einkapseln von magnetischen Mikrokügelchen und Mikrokugeln mit unterschiedlichen Oberflächenfunktionalisierung verwendet werden könnte , kann nützlich sein , 44 zu erwarten.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Tomoko Yamaguchi in Abbildung 1 die schematische Bild zeichnen. Diese Studie wurde von der Okazaki ORION-Projekt des Okazaki-Instituts für Integrative Bioscience der Nationalen Behörde Institutes of Natural Sciences (NINS) unterstützt; von der Astrobiologie-Center Project (kein AB281010.) von NINS; durch einen Zuschuss-in-Aid for Scientific Research für innovative Bereiche (Dynamical Bestellung von biomolekularen Systemen für die Erstellung von integrierten Funktionen) von der japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) (kein 25.102.008.); durch einen Zuschuss-in-Aid für junge Wissenschaftler (B) (KK, kein 15K17850.) von JSPS; unddurch ein Zuschuss-in-Beihilfen für Forschung Aktivität Start-Up (bis YN, Nr. 15H06653) von JSPS. Zusätzliche Unterstützung wurde durch einen Zuschuss aus dem Noguchi Institute, einen Zuschuss von der Kao-Stiftung für Wissenschaft und Kunst, und einen Zuschuss aus dem Kurita Water and Environment Foundation zur Verfügung gestellt.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |