Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
La biología constructiva y el enfoque de la biología sintética para crear vida artificial implican el montaje de abajo hacia arriba de los materiales biológicos o no biológicos. Tales enfoques han recibido considerable atención en la investigación en el límite entre la vida y la materia no viviente y se han utilizado para construir células artificiales durante las últimas dos décadas. En particular, Giant vesículas (GVs) a menudo se han utilizado como membranas de las células artificiales. En este trabajo se describe la preparación de microesferas que encapsulan Planos generales altamente empaquetadas como modelo de células que contienen biomoléculas altamente condensadas. Los GVs se prepararon por medio de un simple método de centrifugación emulsión de agua-en-aceite. Específicamente, un homogeneizador se utilizó para emulsionar una solución acuosa que contiene los materiales a encapsular y un aceite que contiene fosfolípidos disueltos, y la emulsión resultante se dispuso en capas cuidadosamente sobre la superficie de otra solución acuosa. A continuación, el sistema de capas se centrifugó to generar los Planos generales. Esta potente método fue utilizado para encapsular materiales que van desde moléculas pequeñas a microesferas.
El enfoque de la biología constructiva, o sintético es una avenida fascinante para explorar la frontera entre la vida y la materia no viva. Debido a que la célula es la unidad mínima requerida para la vida tal como la entendemos en la actualidad que, varios investigadores han intentado construir células artificiales de productos químicos simples, bien entendidas de modo que los fenómenos que se producen dentro de tales células artificiales pueden ser estudiadas, con el objetivo final de la aclaración los orígenes de la vida y el estudio de las funciones fundamentales de las células vivas 1, 2, 3. En particular, las vesículas 4, que son microcompartments esféricas hechas de moléculas anfifílicas y pueden encapsular moléculas biológicas tales como proteínas 5, 6 y 7 de ADN, 8, 9,lass = "xref"> 10, a menudo se han utilizado como modelos de las membranas biológicas.
Las vesículas se pueden clasificar como pequeño (definida como que tiene un diámetro de <100 nm), grandes (diámetro de <1 m), o gigante (diámetro> 1 m). vesículas gigantes (GVS) se han estudiado ampliamente, ya que son similares a las células que viven en el tamaño, la forma y la estructura. Debido al tamaño de GVs, cambios morfológicos en las membranas GV fácilmente se pueden observar en tiempo real en un microscopio óptico.
Varios métodos para la preparación de GVs se ha informado de 11, incluyendo el método de hidratación 12, 13, el método de congelación-descongelación 14, el método electroformation 15, 16, y el método de dispositivo fluídico 17, 18. proteínas Sin embargo, encapsulación y otros macromolecules de GVS en altas concentraciones por medio de estos métodos es difícil. En particular, es extremadamente difícil para encapsular materiales biológicos en cantidad suficiente (20 a 30% en volumen) para imitar el entorno lleno de gente dentro de las células 19, 20. Planos generales para formar instantáneamente, Weitz y compañeros de trabajo estableció una emulsión agua-en-aceite método de centrifugación emulsión 21, 22 (W / O). Este método tiene cinco características importantes. En primer lugar, porque GVs preparados por este método tienen una baja lamelaridad 23, 24, sus membranas son tan delgadas que se pueden deformar fácilmente. GV deformación de la membrana inducida por FtsZ (una proteína de división celular bacteriana), tubulina, y otras macromoléculas se ha estudiado 25, 26, 27, 28, y se observó polyhe Dron-como la deformación de las membranas GV inducidos por la encapsulación de microesferas 29, 30. En segundo lugar, las proteínas de membrana se pueden insertar en la membrana vesicular con este método, aunque con dificultad 31. Por ejemplo, el grupo Yomo utiliza este método para estudiar la síntesis in vitro y la actividad de formación de poros de la proteína de membrana α-hemolisina 32. En tercer lugar, es posible generar GVs asimétricos en la que los componentes lipídicos de los velos interior y exterior son diferentes 22. Por ejemplo, Whittenton et al. Planos generales asimétricas con lípidos catiónicos en la cara interna de encapsular polinucleótidos cargados negativamente, y con los lípidos neutros sobre la cara externa para disminuir la toxicidad y la captación celular no específica 33. En cuarto lugar, la fracción de la concentración y el volumen de las sustancias dentro de las GVs puede ser relativamente altos = "xref"> 28, 34. En quinto lugar, múltiples tipos de materiales se pueden encapsular 35. Por ejemplo, Nishimura et al. encapsulado un sistema de transcripción-traducción in vitro en GVs y utilizado el sistema para expresar la proteína verde fluorescente (GFP) dentro de la GVs 36. Estas cinco características hacen w / o centrifugación emulsión de un método indispensable para la generación de Planos generales que imitan celulares.
En trabajos anteriores, GVs generados por centrifugación se recogieron por medio de una jeringa equipada con una larga 16 G aguja de acero inoxidable que contiene algo de la solución acuosa final 22. En las manos de los técnicos sin experiencia, este método de recogida podría fácilmente dar lugar a la contaminación de la GV con un poco de aceite. En este estudio, hemos utilizado el protocolo de centrifugación emulsión w / o desarrollado por el grupo de Yomo 23, 37,en el que GVs precipitados se recogen a través de un orificio abierto en la parte inferior del tubo de centrífuga en la que se preparan. Preparamos GVs encapsulantes 1.0 micras microesferas, que son similares en tamaño a orgánulos intracelulares. El uso de microesferas nos permitió estimar su concentración mediante el cálculo de la fracción de volumen. Establecimiento de un método para la preparación de Planos generales en las que los materiales con una gran densidad es un paso importante para la creación de células artificiales. Para confirmar la utilidad de nuestro protocolo de varios tipos de materiales de interiores, también hemos demostrado que la GFP y una soluble en agua pequeña molécula fluorescente (uranina) podrían ser encapsulados en los GVs.
Los pesos específicos del medio de dispersión acuosa interna y la solución acuosa externa deben ser elegidos cuidadosamente. Para la emulsión w / o para precipitar en la solución acuosa externa durante la centrifugación, la gravedad específica del medio de dispersión acuosa interna debe ser mayor que la de la solución acuosa externa. Tratamos de preparar Planos generales que utilizan soluciones de interior y exterior, sin azúcares, pero que no ha obtenido Planos generales en estas condiciones, ya que la solución acuosa interna no tiene suficiente masa para cruzar la interferencia entre las dos fases. Si hay una gran diferencia de presión osmótica entre las dos soluciones, GVs que precipitan en la solución acuosa externa puede encogerse o ruptura. Por lo tanto, la presión osmótica dentro y fuera de los Planos generales deben ser iguales. Para lograr esto, se utilizó sacarosa como un soluto en la dispersión acuosa interna y la glucosa como un soluto en la solución acuosa externa; ambos azúcares estaban en la misma concentración. tanto la salss = "xref"> 22 y el azúcar 23, 35, 38 se han utilizado para estos fines, pero el azúcar se emplea generalmente porque es menos tóxico y más soluble que la sal. Sin embargo, si se añade un exceso de azúcar, los GVs pueden entrar en contacto con la parte inferior de la cubierta de vidrio y el colapso. Hay varias estrategias para evitar esto. Una estrategia es reducir la diferencia de gravedad específica entre las soluciones acuosas interna y externa de modo que las GVs precipitan en condiciones suaves; En concreto, el sobrenadante de la dispersión GV precipitado puede ser intercambiada con una solución que es idéntica a la solución acuosa interna para reducir la posibilidad de ruptura vesicular por adhesión a la cubierta de vidrio, como resultado de la flotabilidad. Otra estrategia consiste en pre-recubrimiento tanto de cubiertas de vidrio con una película delgada de lípidos 29.
La preparación adecuada y la incubación de la emulsión seimportante. Se utilizó parafina líquida para preparar la solución de aceite. De aceite 26, 31, dodecano 21, 33, 33 y escualeno mineral, 39 también se utilizan a menudo como aceites disolventes. Debido a que estos materiales varían en gravedad específica, la viscosidad y la tensión superficial, diferentes números de vesículas se forman incluso cuando se utilizan las mismas condiciones de centrifugación 33. Para obtener las vesículas con las propiedades del objetivo, es esencial para optimizar las gravedades y viscosidades de las soluciones acuosas interna y externa específicos, así como la preparación acceleration.For centrífuga de la fase de aceite, la incubación debe ocurrir a alta temperatura y en un lugar seco medio ambiente, como una incubadora o un deshidratador. En este estudio, hemos calentado el aceite de parafina a 80 ° C para disolver completamente el lípido molecules.In Además, la emulsión debeestar preparado sólo cuando sea necesario y debe ser sometido inmediatamente a centrifugación, ya que es inestable justo después de que se prepara y la w / o gotas se funden fácilmente entre sí. La emulsión se puede preparar en grandes cantidades por sonicación, agitación en vórtex, o tapping. Sin embargo, usando un homogeneizador permite la rápida preparación de grandes cantidades de emulsión y más fácil emulsificación en aceite con una alta viscosidad. También es importante que la emulsión se capas en la solución acuosa externa suavemente y rápidamente y después se enfrió a 4 ° C. Para acortar el tiempo entre la emulsificación y la centrifugación, el sistema de solución acuosa de aceite exterior se puede preenfriar antes de la emulsión se acoda en él, y todo el sistema puede entonces centrifugarse immediately.If la turbidez blanca aparece más rápido o más lento de lo normal, el mecánico homogeneizador debe enjuagarse a fondo para eliminar los detergentes de limpieza. Además, antes de la emulsificación, la solución de aceite, solución acuosa interna, y el emulsionante debe ser returned a temperatura ambiente.
aceleración centrífuga adecuada también es importante. Por centrifugación a 18.000 x g, hemos sido capaces de preparar Planos generales con un único material interior encapsulado en una alta concentración. Cuando se requiere la encapsulación de múltiples materiales, es mejor reducir la aceleración centrífuga. Por ejemplo, se consiguió un sistema de montaje de actina encapsular siete compuestos con centrifugación a menos de 350 x g 35. En los casos en los que la centrifugación no es deseable, GVs se puede obtener mediante el ajuste de la concentración de azúcar o por precipitación de la emulsión bajo la influencia de su propia masa 38, 40, 41.
El método descrito en este documento tiene dos limitaciones importantes. Una de ellas es que las moléculas de aceite de parafina, (en este caso) pueden ser solubilizados en la membrana GV, como ha sido señalado por la Weitgrupo Z 21. Cuando se desea la inserción de una proteína de membrana en la membrana GV, se deben considerar los efectos de las moléculas de aceite co-existentes en la proteína. La otra limitación es la variación de la fracción de volumen. En este estudio, se estimó que las fracciones en volumen de microesferas en los Planos generales oscilaron entre 4-30% en volumen; las fracciones en volumen no fueron idénticas a la fracción de volumen de la solución acuosa interna utilizada para la preparación GV. Aunque hemos sido capaces de encapsular microesferas en las GVs en una fracción de volumen lo suficientemente alto como para la observación de microscopía, este método no es adecuado para la preparación de GVs con una distribución uniforme fracción de volumen. Se ha informado de que la distribución de fracciones de volumen de microesferas cambia durante la centrifugación 34.
El método de centrifugación emulsión w / o se utiliza comúnmente para la formación de GVs que contienen materiales encapsulados. Sin embargo, algunos informes han descrito la preparación de los Planos generales que encapsulan materiales microescala 34, 42. Recientemente, robots moleculares que contienen un dispositivo de ADN encapsulado o un dispositivo molecular se han construido 43, 44. Planos generales con compartimentos son la primera opción para este tipo de aplicaciones; por lo tanto, las técnicas, tales como el nuestro, que podrían utilizarse para encapsular microesferas magnéticas y microesferas con diversa funcionalización de la superficie se puede esperar que sea útil 44.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Tomoko Yamaguchi para dibujar la imagen esquemática en la figura 1. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ORION Okazaki del Instituto Okazaki Integral de Biociencia de theNational Institutos de Ciencias Naturales (NINS); por el Centro de proyectos de Astrobiología (sin AB281010.) de NIÑS; por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (ordenamiento dinámico de sistemas biomoleculares para la creación de funciones integradas) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) (sin 25.102.008.); por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B) (a KK, sin 15K17850.) de JSP; andby una subvención-en-Ayudas a la Investigación Actividad de puesta en marcha (a YN,. sin 15H06653) de JSP. El apoyo adicional fue proporcionada por una subvención del Instituto Noguchi, una beca de la Fundación Kao de las Artes y las Ciencias, y una beca de la Fundación Agua y Medio Ambiente Kurita.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |