Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
건설적인 생물학 및 인공 생명을 만드는 합성 생물학 접근 방식은 생물학적 또는 비 생물학적 물질의 상향식 (bottom-up) 어셈블리를 포함한다. 이러한 접근 방식은 생활과 무생물 문제 사이의 경계에 대한 연구에 상당한 관심을받은 지난 20 년 동안 인공 세포를 구성하는 데 사용되었다. 특히, 거대 소포 (GVS)는 종종 인공 세포막로서 사용되어왔다. 본 논문에서는 고도로 응축 된 생체 분자를 포함하는 셀의 모델로 높은 포장 마이크로 캡슐화 GVS의 준비에 대해 설명합니다. GVS 간단한 유 중수 에멀젼을 원심 분리 방법에 의해 제조 하였다. 즉, 균질의 물질이 캡슐화 함유하는 수용액에 용해 인지질을 함유하는 오일을 유화하는 데 사용하고, 생성 된 에멀젼을 다른 수용액의 표면 상에 조심스럽게 적층했다. 계층화 된 시스템은 t을 원심 분리O를 GVS를 생성합니다. 이 강력한 방법은 작은 분자 미립자에 이르는 물질을 캡슐화하기 위해 사용되었다.
건설적인, 또는 합성 생물학 접근 방식은 생활 사이의 경계를 탐구하고 문제를 무생물을위한 매력적인 수단이다. 셀은 생활에 필요한 최소 단위이기 때문에 우리는 현재를 이해, 다양한 연구자 인공 세포 내에서 발생하는 현상을 연구 할 수 있도록 해명의 궁극적 인 목표와 함께, 간단한, 잘 알려진 화학 물질 인공 세포를 구성하는 시도 삶의 기원과 살아있는 세포 1, 2, 3의 기본적인 기능을 연구. 특히, 4 소포 양친 매성 분자로 이루어지는 구형의 미세 구획은 이러한 단백질 5, 6, DNA 7, 8, 9 등의 생체 분자를 캡슐화 할 수있는,아가씨 = "외부 참조"> (10)는 종종 생체막의 모델로 이용되고있다.
소체는, 크게 (직경 <1 ㎛) 또는 거 (직경> 1 ㎛) (<100 nm의 직경을 갖는 것으로 정의 됨) 소형으로 분류 될 수있다. 들은 크기, 형상 및 구조로 살아있는 세포 유사하기 때문에 거대 소체 (GVS)은 광범위하게 연구되어왔다. GVS의 크기에 의해, GV 멤브레인의 형태 학적 변화를 용이하게 광학 현미경으로 실시간으로 관찰 할 수있다.
GVS 제조 방법은 여러 가지 수화 제 12, 13, 동결 융해 법 (14), 전기 주조 방법 (15, 16), 상기 유체 기기에있어서 17, 18를 포함하여 11보고되었다. 그러나, 캡슐화 단백질 및 기타 macrom이러한 방법에 의한 고농도 GVS에 olecules 어렵다. 특히, 셀 (19), (20) 내부의 혼잡 환경을 모방하기에 충분한 양 (20 내지 30 부피 %)의 생체 물질을 캡슐화하는데 매우 도전적이다. GVS 즉시, 바이 츠 동료 유화 원심 분리 방법 (21, 22) (W / O) 유중 설립 형성한다. 이 방법은 다섯 가지 중요한 기능을 가지고 있습니다. 이 방법에 의해 제조 GVS 낮은 lamellarity 23 (24)을 가지고 있기 때문에 첫째, 세포막은 쉽게 변형 될 수있는 정도로 얇다. FtsZ (세균 세포 분열 단백질), 튜 불린 및 기타 거대 분자에 의해 유도 GV 막의 변형은 27, 26, 25 (28)을 연구하고 있으며, 우리는 polyhe 관찰 구체 (29) (30)의 밀봉에 의한 GV 막의 dron 형상 변형. 둘째, 막 단백질 31 어려움 불구이 방법에 의해 소포 막에 삽입 될 수있다. 예를 들어, Yomo 그룹은 막 단백질 α-32의 용혈 관내 합성 및 기공 형성 활성을 연구하기 위해이 방법을 사용 하였다. 셋째, 내측 및 외측 소엽의 지질 성분이 다른 22되는 비대칭 GVS를 생성 할 수있다. 예를 들어이 Whittenton 외. 음으로 하전 된 폴리 뉴클레오티드를 캡슐화하는 내부 전단지에 양이온 성 지질,와 외부 전단지에 중성 지질과 생성 비대칭 GVS는 독성과 특이 세포 흡수 (33)을 감소시킵니다. 넷째, GVS 내부 물질의 농도 및 부피 분율이 상대적으로 높을 수있다S = "외부 참조"> 28, 34. 다섯째, 재료의 여러 가지 유형 (35)을 캡슐화 할 수있다. 예를 들면은, 니시무라 외. GVS로 시험 관내 전사 번역 시스템을 캡슐화하고 GVS 36에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 시스템을 사용 하였다. 이 다섯 기능은 유화 원심 분리 세포 흉내 GVS를 생성하기위한 필수적인 방법 O / w를 확인합니다.
이전 연구에서, 원심 분리에 의해 생성 GVS 최종 수용액 (22)의 일부를 포함하는 길이 16 G 스테인리스 바늘이 장착 된 주사기를 이용하여 수집 하였다. 미숙 기술자의 손이 수집 방법 쉽게 오일의 일부와 GV의 오염을 초래할 수있다. 본 연구에서 우리는 Yomo 기 (23), (37)에 의해 개발 된 W / O 에멀젼을 원심 분리 프로토콜을 사용구멍들이 제조되는 원심 관의 하단 연 통하여있는 GVS 침전을 수거한다. 우리는 세포 내 소기관의 크기와 비슷합니다 1.0 μm의 미소를 캡슐화 GVS를 준비했다. 마이크로 스피어의 사용은 우리가 체적 분율을 계산하여 농도를 추정 할 수 있었다. 물질이 조밀되는 GVS의 제조 방법의 확립 인공 세포를 생성하기위한 중요한 공정이다. 내부 재료의 다양한 유형에 대한 우리의 프로토콜의 유틸리티를 확인하려면, 우리는 또한 GFP와 작은 수용성 형광 분자 (uranine)가 GVS에 캡슐화 될 수 있음을 보여 주었다.
내부 수계 분산매 및 외측 수성 용액의 비중은 신중하게 선택되어야한다. 원 / O 에멀젼을 원심 분리시의 외측 수성 용액에 침전하기 위해서는 내부 수계 분산 매체의 비중 외측 수용액보다 커야한다. 우리는 설탕없이 내부 및 외부 솔루션을 사용하여 GVS을 준비하려고했으나 내부 수용액이 두 단계 사이의 간섭을 통과하기에 충분한 질량을 가지고 있지 않았기 때문에 우리는 이러한 조건에서 더 GVS을 얻을 수 없습니다. 축소하거나 파열 될 수도 외측 수용액에 침전 두 솔루션 GVS 사이에 큰 삼투압 차이가있는 경우. 따라서, 내부와 외부 GVS 삼투압은 같아야합니다. 이를 위해, 우리는 외측 수성 용액에 용질로서 내측 수성 분산액 및 글루코스 용질로서 자당을 사용하는; 모두 당 동일한 농도로 하였다. 두 소금SS = "외부 참조"> 설탕 22 23, 35, 38 등의 목적으로 사용되고 있지만, 덜 독성 염보다 용해성 때문에 당 보통 사용된다. 설탕을 너무 많이 첨가하면 그러나 GVS 커버 유리와 붕괴의 바닥과 접촉 할 수있다. 이를 피하기위한 몇 가지 전략이있다. 하나의 전략은 GVS 온화한 조건 하에서 침전되도록 내측 및 외측 수성 용액 사이의 비중 차이를 감소시키는 것이다; 구체적으로는, 침전 GV 분산액의 상등액 부력의 결과로서 덮개 유리를 접착하여 소포 파괴의 가능성을 줄이기 위해 내부 수용액 동일한 용액으로 교환 될 수있다. 또 다른 전략은 얇은 지질막 29 커버 유리를 모두 프리 코트한다.
에멀젼의 적절한 준비와 배양된다중대한. 우리는 오일 용액을 제조하는 액체 파라핀을 사용했다. 미네랄 오일 26, 31, 21 도데 칸, (33)과 스쿠알렌 (33), (39)는 종종 용매 오일로 사용된다. 이들 재료는 비중, 점도 및 표면 장력에 차이가 있으므로 동일한 원심 분리 조건 (33)을 사용하는 경우, 소포 상이한 개수도 형성한다. 타겟 특성 소포를 얻기 위해서는,이 비중 및 내외 수용액의 점도뿐만 아니라 오일상의 원심 acceleration.For 제제를 최적화하는 것이 필수적이며, 배양 높은 온도에서 건조 발생해야 환경 인큐베이터 또는 탈수기 등. 본 연구에서는 완전히 지질 molecules.In 첨가 용해 80 ° C로 유동 파라핀을 가열하여 에멀젼해야필요하고는 제조 직후 불안정하므로 즉시 원심 분리한다로만 제조 할 방울이 쉽게 서로 융합 / O w 에멀젼 초음파, 볼 텍싱 또는 탭하여 대량으로 제조 할 수있다. 다만, 호모 게 나이저를 사용하면 고점도 오일 에멀젼 다량의 신속한 제조 쉽게 유화 가능하다. 이 에멀젼은 부드럽게 신속하고 4 ℃에서 후 냉장 외부 수용액에 적층하는 것이 중요하다. 유화 원심 분리 사이의 시간을 단축하기 위해, 오일 외측 수용액 시스템은 에멀젼이 그 상에 적층하기 전에 예냉 할 수 있고, 백탁이 빠르거나 느린 평소보다 기계적 표시 immediately.If 전체 시스템은 원심 분리 될 수있다 균질는 철저하게 청소 세제를 제거하는 세척해야합니다. 또한, 유화 전, 오일 용액, 내측 수성 용액 및 유화제 R 있어야실온 eturned.
적절한 원심 가속도도 중요하다. 18,000 x g에서 원심 분리함으로써 고농도로 캡슐화 한 내장재로 GVS을 제조 할 수 있었다. 복수의 재료의 밀봉이 요구되는 때, 원심 가속도를 저감하는 것이 좋다. 예를 들어, 일곱 화합물을 캡슐화 액틴 조립 시스템은 350 미만의 X g에서 원심 분리 (35)로 이루어졌다. 원심 분리가 바람직 인 경우 GVS는 당 농도를 조정하거나 그 자체 매스 (38), (40), (41)의 영향 하에서 에멀젼을 침전에 의해 얻어 질 수있다.
여기에보고 된 방법은 두 가지 제한 사항이 있습니다. Weit 의해 지적 된 바와 같이 하나의 GV 막 가용화 할 수있다 (이 경우에는 파라핀)이 오일 분자 인Z 그룹 21. GV 막으로 세포막 단백질의 삽입이 요구되는 경우 단백질에 공존 오일 분자의 영향이 고려되어야한다. 다른 제한은 체적 분율의 변화이다. 본 연구에서는 GVS 미소 구의 부피 분획을 4-30 부피 %에서 원거리 추정; 부피 분획 GV 제제에 사용되는 내부 수용액의 부피비 동일하지 않았다. 우리는 현미경 관찰 충분히 높은 부피비에서 GVS에 미세 캡슐화 할 수 있었지만,이 방법은 균일 한 부피 분율 분포 GVS의 제조에 적합하지 않다. 이는 미세 체적 분율의 분포가 원심 34 중의 변경 것으로보고되었다.
원 / O 에멀젼을 원심 분리 방법은 일반적으로 캡슐화 된 물질을 함유 GVS의 형성에 사용된다. 그러나, 몇 가지 보고서는 페이지를 설명했다마이크로 재료 (34), (42)을 캡슐화 GVS의 배상. 최근에 캡슐화 된 DNA 장치 또는 분자 장치를 포함하는 분자 로봇 (44) (43)로 구성되어있다. 구획 GVS는 이러한 종류의 응용 프로그램에 대한 첫 번째 선택이다; 따라서, 다양한 표면 작용으로 자성 구체 및 미세 캡슐화에 사용될 수 등 우리 같은 기술은, 44 유용한 것으로 예상 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그림 1에 개략적 인 이미지를 그리기 위해 야마구치 토모코 감사합니다. 본 연구는 자연 과학의 theNational 연구소의 통합적인 생명의 오카자키 연구소의 오카자키 ORION 프로젝트 (NINS)에 의해 지원되었다; 우주 생물학 센터 프로젝트 NINS의 (. 더 AB281010)에 의해; (. 어떤 25102008) 혁신 분야의 과학 연구 (통합 기능의 창조를위한 생체 분자 시스템의 역학적 순서) 과학 진흥 일본 사회에서에 대한 보조금의 원조 (JSPS)에 의해; 젊은 과학자에 대한 보조금의 원조 (B)에 의해 (KK에, 15K17850 없음.) JSPS에서; andby 그랜트 -에 – 보조 연구 활동 스타트 업에 대한 (YN에, 아니. 15H06653) JSPS에서. 추가 지원은 노구치 연구소, 예술과 과학의 카오 재단 보조금, 그리고 쿠 리타 물과 환경 재단 보조금에서 교부금에 의해 제공되었다.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |