Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
La biologia costruttiva e l'approccio biologia sintetica per creare la vita artificiale coinvolgono il gruppo bottom-up di materiali biologici o non biologici. Tali approcci hanno ricevuto una notevole attenzione nella ricerca sul confine tra la vita e la materia non vivente e sono stati utilizzati per la costruzione di cellule artificiali nel corso degli ultimi due decenni. In particolare, Giant vescicole (GVs) sono state spesso usate come le membrane delle cellule artificiali. In questo articolo, si descrive la preparazione di GVs incapsulamento microsfere altamente imballato come un modello di cellule contenenti biomolecole altamente condensati. Le GVs sono stati preparati mediante un metodo semplice un'emulsione centrifugazione acqua-in-olio. In particolare, un omogeneizzatore è stato usato per emulsionare una soluzione acquosa contenente i materiali da incapsulati e un olio contenente fosfolipidi disciolti, e l'emulsione risultante è stato stratificato con attenzione sulla superficie di un'altra soluzione acquosa. Il sistema stratificato è stato poi centrifugato to generare i GVs. Questo metodo potente è stato utilizzato per incapsulare materiali che vanno da piccole molecole a microsfere.
L'approccio di biologia costruttiva, o sintetico è una strada interessante per esplorare il confine tra vita e materia non vivente. Poiché la cellula è l'unità minima richiesta per la vita come noi oggi lo intendiamo, vari ricercatori hanno tentato di costruire cellule artificiali da semplici, prodotti chimici ben compresi in modo che i fenomeni che si verificano all'interno di tali cellule artificiali possono essere studiati, con l'obiettivo finale di chiarire le origini della vita e lo studio delle funzioni fondamentali delle cellule viventi 1, 2, 3. In particolare, vescicole 4, che sono microcompartments sferiche fatte di molecole anfifiliche e possono incapsulare molecole biologiche come proteine 5, 6 e DNA 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, sono spesso stati utilizzati come modelli di membrane biologiche.
Vescicole possono essere classificati come piccole (definito come avente un diametro <100 nm), grande (diametro <1 um), o gigante (diametro> 1 micron). vescicole giganti (GVS) sono stati ampiamente studiati, perché sono simili alle cellule viventi in termini di dimensioni, forma e struttura. A causa delle dimensioni del GVs, cambiamenti morfologici nelle membrane GV possono facilmente osservare in tempo reale al microscopio ottico.
Diversi metodi per la preparazione GVs sono stati riportati 11, compreso il metodo idratazione 12, 13, il metodo di congelamento-scongelamento 14, il metodo electroformation 15, 16, e il metodo dispositivo fluidico 17, 18. Tuttavia, incapsulamento proteine e altri MACROMolecules in GVs ad alte concentrazioni mediante questi metodi è difficile. In particolare, è estremamente difficile per incapsulare materiali biologici in quantità sufficiente (20-30% vol) per simulare l'ambiente affollato all'interno delle cellule 19, 20. Per formare GVs istantaneamente, Weitz e colleghi ha istituito un acqua-in-olio (w / o) metodo di emulsione centrifugazione 21, 22. Questo metodo ha cinque caratteristiche importanti. In primo luogo, perché GVs preparati mediante questo metodo hanno bassa lamellarity 23, 24, le membrane sono così sottili che possono essere deformati facilmente. GV deformazione della membrana indotta da FtsZ (una proteina divisione cellulare batterica), tubulina, e altre macromolecole è stata studiata 25, 26, 27, 28, e abbiamo osservato polyhe dron simile deformazione delle membrane GV indotti da incapsulamento di microsfere 29, 30. In secondo luogo, proteine di membrana possono essere inseriti nella membrana vescicolare con questo metodo, anche se con difficoltà 31. Ad esempio, il gruppo Yomo usato questo metodo per studiare la sintesi in vitro e l'attività formano pori della proteina di membrana α-emolisina 32. In terzo luogo, è possibile generare GVs asimmetriche in cui i componenti lipidici delle foglioline interni ed esterni sono differenti 22. Ad esempio, Whittenton et al. GVs asimmetriche generate con lipidi cationici nel volantino interno per incapsulare polinucleotidi carica negativa, e con lipidi neutri sul foglietto esterno per diminuire la tossicità e non specifici assorbimento cellulare 33. In quarto luogo, la frazione concentrazione e volume delle sostanze all'interno delle GVs può essere relativamente elevatos = "xref"> 28, 34. In quinto luogo, diversi tipi di materiali possono essere incapsulati 35. Ad esempio, Nishimura et al. incapsulato un sistema di trascrizione-traduzione in vitro in GVs e utilizzato il sistema per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del GVs 36. Questi cinque caratteristiche rendono w / o emulsione centrifugazione un metodo indispensabile per la generazione di cellule GVs-imitando.
Nel lavoro precedente, GVs generati mediante centrifugazione sono stati raccolti mediante una siringa dotata di una lunga 16 ago G inossidabile contenente alcune della soluzione acquosa finale 22. Nelle mani dei tecnici inesperti, questo metodo di raccolta potrebbe facilmente provocare la contaminazione della GV con una parte dell'olio. In questo studio, abbiamo utilizzato il protocollo di emulsione centrifugazione w / o sviluppato dal gruppo Yomo 23, 37,in cui GVs precipitati vengono raccolti attraverso un foro aperto sul fondo della provetta in cui vengono preparati. Abbiamo preparato GVs incapsulamento 1.0 micron microsfere, che sono di dimensioni simili a organelli intracellulari. L'uso di microsfere permesso di stimare la concentrazione calcolando la frazione di volume. Creazione di un metodo per la preparazione di GVs in cui i materiali sono densamente imballati è un passo importante per la creazione di cellule artificiali. Per confermare l'utilità del nostro protocollo di vari tipi di materiali interni, abbiamo anche dimostrato che GFP e un piccolo idrosolubile molecola fluorescente (uranine) possono essere incapsulati nei GVs.
I pesi specifici del mezzo di dispersione acquosa interna e la soluzione acquosa esterna devono essere scelti con attenzione. Per l'emulsione w / o precipitazione nella soluzione acquosa esterna durante la centrifugazione, il peso specifico del mezzo di dispersione acquosa interna deve essere maggiore di quella della soluzione acquosa esterna. Abbiamo cercato di preparare GVs utilizzano soluzioni interne ed esterne senza zuccheri, ma ottenuto non GVs in queste condizioni, perché la soluzione acquosa interna non ha abbastanza massa attraversare l'interferenza tra le due fasi. Se vi è una grande differenza di pressione osmotica tra le due soluzioni, GVs che precipitano nella soluzione acquosa esterna può ridursi o rottura. Pertanto, la pressione osmotica dentro e fuori le GVs deve essere uguale. Per realizzare ciò, abbiamo utilizzato saccarosio come soluto in dispersione acquosa interna e glucosio come un soluto nella soluzione acquosa esterna; entrambi gli zuccheri erano alla stessa concentrazione. sia il saless = "xref"> 22 e zucchero 23, 35, 38 sono stati utilizzati per tali scopi, ma lo zucchero è normalmente impiegate perché è meno tossico e più solubile del sale. Tuttavia, se viene aggiunto troppo zucchero, i GVs possono venire a contatto con la parte inferiore del vetro di copertura e collasso. Ci sono diverse strategie per evitare questo. Una strategia è di ridurre la differenza peso specifico tra le soluzioni acquose interno ed esterno in modo che i GVs precipitano in condizioni blande; in particolare, il surnatante della dispersione GV precipitato può essere scambiata con una soluzione che è identica alla soluzione acquosa interna per ridurre la possibilità di rottura vescicolare per adesione al vetro di copertura a seguito di galleggiamento. Un'altra strategia è quella dello strato preliminare sia di vetrini con un sottile film lipidico 29.
La preparazione adeguata e incubazione dell'emulsione vengonoimportante. Abbiamo usato paraffina liquida per preparare la soluzione di olio. Oli minerali 26, 31, dodecano 21, 33, e squalene 33, 39 sono spesso usati come oli solventi. Poiché questi materiali vari in peso specifico, viscosità e tensione superficiale, un diverso numero di vescicole formano anche quando vengono utilizzate le stesse condizioni di centrifugazione 33. Per ottenere le vescicole con le proprietà di destinazione, è essenziale ottimizzare le gravità e viscosità delle soluzioni acquose interne ed esterne specifiche, nonché la preparazione acceleration.For centrifuga della fase olio, incubazione deve avvenire ad alta temperatura e in un luogo asciutto ambiente come incubatore o un disidratatore. In questo studio, abbiamo riscaldato la paraffina liquida a 80 ° C per sciogliere completamente i lipidi molecules.In Inoltre, l'emulsione dovrebbemeglio solo se necessario e dovrebbe essere immediatamente sottoposto a centrifugazione perché instabile subito dopo che è preparato e il w / o goccioline facilmente fondono l'uno all'altro. L'emulsione può essere preparato in grandi quantità mediante sonicazione, vortex, o maschiatura. Tuttavia, utilizzando un omogeneizzatore consente la rapida preparazione di grandi quantità di emulsione e più facile emulsione in olio ad alta viscosità. E 'anche importante che l'emulsione essere stratificato sulla soluzione acquosa esterna delicatamente e rapidamente e poi raffreddata a 4 ° C. Per ridurre il tempo tra la emulsione e centrifugazione, il sistema della soluzione acquosa olio esterno può essere prechilled prima l'emulsione è stratificato su di esso, e l'intero sistema può essere quindi centrifugata immediately.If la torbidità bianca appare più velocemente o più lentamente rispetto al solito, il meccanico omogeneizzatore deve essere accuratamente lavato per rimuovere detergenti. Inoltre, prima emulsione, soluzione in olio, soluzione acquosa interna, ed emulsionante devono essere returned a temperatura ambiente.
La corretta accelerazione centrifuga è importante. Per centrifugazione a 18.000 x g, siamo stati in grado di preparare GVs con un unico materiale interno incapsulato ad alta concentrazione. Quando è richiesta l'incapsulamento di materiali diversi, è preferibile ridurre l'accelerazione centrifuga. Ad esempio, un sistema di assemblaggio actina incapsulamento sette composti è stato ottenuto con centrifugazione a meno di 350 x g 35. Nei casi in cui la centrifugazione è indesiderabile, GVs può essere ottenuto regolando la concentrazione di zuccheri o per precipitazione l'emulsione sotto l'influenza della propria massa 38, 40, 41.
Il metodo qui riportate ha due limiti importanti. Uno è che le molecole di olio di paraffina (, in questo caso) può essere solubilizzati nella membrana GV, come è stato rilevato dalla Weitgruppo z 21. Quando l'inserimento di una proteina di membrana nella membrana GV si desidera, gli effetti delle molecole di olio coesistenti sulla proteina devono essere considerati. L'altra limitazione è la variazione della frazione di volume. In questo studio, abbiamo stimato che le frazioni di volume di microsfere nelle GVs variava 4-30% in volume; le frazioni di volume non erano identici alla frazione di volume della soluzione acquosa interna utilizzati per la preparazione GV. Anche se siamo stati in grado di incapsulare microsfere nelle GVs ad una frazione di volume sufficiente per l'osservazione al microscopio, questo metodo non è adatto per la preparazione di GVs con una distribuzione frazione di volume uniforme. E 'stato riportato che la distribuzione delle microsfere frazioni volumetriche cambia durante la centrifugazione 34.
Il metodo di emulsione centrifugazione w / o viene comunemente utilizzato per la formazione di GVs contenenti materiali incapsulati. Tuttavia, pochi studi hanno descritto la priparazione di GVs incapsulamento materiali microscala 34, 42. Recentemente, robot molecolari contenenti un dispositivo DNA incapsulato o un dispositivo molecolare sono stati costruiti 43, 44. GVs con scomparti sono la prima scelta per questo tipo di applicazioni; Pertanto, le tecniche, come la nostra, che potrebbero essere utilizzati per l'incapsulamento microsfere magnetiche e microsfere con diversi funzionalizzazione superficiale si può aspettare di essere utile 44.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Tomoko Yamaguchi per disegnare l'immagine schematica della figura 1. Questo studio è stato sostenuto dal progetto Okazaki ORION dell'Istituto Okazaki for Integrative Bioscience della dell'Ufficio Nazionale Istituti di Scienze Naturali (NINS); dal Centro Progetto Astrobiologia (senza AB281010.) di NINS; da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica su aree innovative (ordinamento dinamico di sistemi biomolecolari per la creazione di funzioni integrate) dalla Società giapponese per la promozione della Scienza (JSP) (senza 25.102.008.); da un Grant-in-Aid per giovani scienziati (B) (a KK, non 15K17850.) da JSPS; andby un Grant-in-Aid per la ricerca di attività Start-Up (a YN, n. 15H06653) da JSPS. Ulteriore supporto è stato fornito da una sovvenzione da parte del Noguchi Institute, una borsa di studio dalla Fondazione Kao per le Arti e delle Scienze, e di una sovvenzione da parte del Kurita Water e Fondazione Ambiente.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |