Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
הביולוגיה בונה גישת הביולוגיה הסינטתית בדרך ליצירת חיים מלאכותיים לערב את ההרכבה מלמטה למעלה של חומרים ביולוגיים או מלאכותיים. גישות כאלה קיבלו תשומת לב רבה במחקר על קו התפר שבין החיים והחומר הדומם שימשו לבניית תאים מלאכותיים בשני העשורים האחרונים. בפרט, הענק שלפוחית (Gvs) לעתים קרובות שמשה קרום תא מלאכותי. במאמר זה, אנו מתארים את הכנת Gvs encapsulating microspheres ארוז מאוד כמודל של תאים המכילים ביומולקולות מרוכז מאוד. Gvs הוכן באמצעות שיטת צנטריפוגה מים ב-שמן תחליב פשוטה. באופן ספציפי, homogenizer שמש ת חלב בתמיסה מימית המכילה את החומרים להיות במארז ואת שמן המכיל פוספוליפידים מומסים, ואת אמולסיה וכתוצאה מכך הייתה מרושת היטב על פני השטח של אחר בתמיסה מימית. מערכת שכבתית אז centrifuged to ליצור את Gvs. שיטה חזקה זו שימשה לתמצת חומרים הנעים בין מולקולות קטנות microspheres.
למשהו הקונסטרוקטיבי, או סינטתית, גישת הביולוגיה היא שדר מרתק לחקור את הגבול שבין החי לבין דומם משנה. בגלל התא הוא היחידה המינימאלית הנדרש עבור חיים כפי שאנו כיום מבינים אותה, חוקרים שונים ניסו לבנות תאים מלאכותיים מן פשוטים, כימיקלים שאנו מבינים היטב כך תופעות המתרחשות בתוך תאים מלאכותיים כגון ניתן ללמוד, עם המטרה הסופית של הבהרה מקור החיים ולומדים את הפונקציות הבסיסיות של תאים חיים 1, 2, 3. בפרט, שלפוחית 4, שהן microcompartments הכדורית עשויות מולקולות amphiphilic ויכולה לתמצת מולקולות ביולוגיות כגון חלבונים 5, 6 ו- DNA 7, 8, 9,= ילדה "Xref"> 10, לעיתים קרובות שימשו כמודלים של ממברנות ביולוגיות.
שלפוחית יכול להיות מסווגת קטן (המוגדרים כבעלי בקוטר של <100 ננומטר), גדול (קוטר <1 מיקרומטר), או ענק (קוטר> 1 מיקרומטר). שלפוחית ענקית (Gvs) נחקרה בהרחבה בגלל שהם דומים תאי חיים בגודל, צורה, מבנה. בשל גודלו של Gvs, שינויים מורפולוגיים בממברנות GV ניתן להבחין בקלות בזמן אמת תחת מיקרוסקופ אופטי.
מספר שיטות להכנת Gvs דווחו 11, כולל השיטה הידרציה 12, 13, שיטת ההפשרה להקפיא 14, שיטת electroformation 15, 16, ושיטת מכשיר fluidic 17, 18. עם זאת, encapsulating חלבוני MACROM האחרolecules ב Gvs בריכוזים גבוהים באמצעות שיטות אלה קשה. בפרט, זה מאוד מאתגר לתמצת חומרים ביולוגיים בכמות מספקת (20-30% בנפח) לחקות את הסביבה הצפופה בתוך תאים 19, 20. כדי ליצור Gvs מיידי, וייץ ועמיתים לעבודה הקימה מים ב-שמן (w / o) צנטריפוגה אמולסיה שיטה 21, 22. לשיטה זו חמש תכונות חשובות. ראשית, משום Gvs שהכין שיטת הזה יש חוסר lamellarity 23, 24, ממברנות שלהם הם כל כך רזה כי הם יכולים להיות מעוות בקלות. דפורמציה קרום GV המושרה על ידי FtsZ (חלבון חלוקת תא חיידק), טובולין, מקרומולקולות אחרות נחקרה 25, 26, 27, 28, ו צפינו polyhe עיוות Dron דמוי של ממברנות GV המושרה על ידי אנקפסולציה של microspheres 29, 30. שנית, ניתן להכניס חלבונים בממברנה לתוך קרום שלפוחי בשיטה זו, אם כי בקושי 31. לדוגמא, קבוצת Yomo השתמשה בשיטה זו כדי לחקור את הסינתזה במבחנה ופעילות יוצרים נקבובית של החלבון הקרומי α-המוליזין 32. שלישית, אפשר ליצור Gvs הסימטרית שבה רכיבי השומנים של העלונים הפנימיים וחיצוניים 22 שונים. לדוגמה, Whittenton et al. Gvs הסימטרית שנוצרה עם שומנים קטיוני בעלון הפנימי לתמצת polynucleotides הטעון שלילי, ועם שומנים ניטראליים על העלון החיצוני כדי להקטין רעילות ו -33 הסלולר ספיגים ספציפי. רביעית, שבר הריכוז והנפח של חומרים בתוך Gvs יכול להיות גבוה יחסיתs = "Xref"> 28, 34. החמישית, סוגי חומרים מרובים יכולים להיות במארז 35. לדוגמה, Nishimura et al. במארז מערכת תרגום-שעתוק במבחנה לתוך Gvs והשתמשתי במערכת לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתוך Gvs 36. תכונות אלה חמש לעשות w / o צנטריפוגה אמולסיה שיטה הכרחית ליצירה Gvs מחק תאים.
בעבודה הקודמת, Gvs שנוצר על ידי צנטריפוגה נאספו באמצעות מזרק מצויד במחט נירוסטה באורך 16 G המכיל חלק בתמיסה מימית הסופי 22. בידי טכנאים מנוסים, בשיטה של איסוף זה יכול לגרום בקלות זיהום של GV עם חלק מהשמן. במחקר זה, השתמשנו פרוטוקול צנטריפוגה תחליב w / o שפותח על ידי קבוצת Yomo 23, 37,שבו Gvs זרז נאסף דרך חור נפתח בתחתית הצינור צנטריפוגות שבו הם מוכנים. הכנו Gvs encapsulating 1.0 מיקרומטר microspheres, הדומות בגודלן אברונים תאיים. שימוש microspheres אפשר לנו להעריך ריכוזם ידי חישוב שבריר הנפח שלהם. הקמת שיטה להכנת Gvs שבו חומרים ארוזים בצפיפות היא צעד חשוב ליצירת תאים מלאכותיים. כדי לאשר את התועלת של הפרוטוקול שלנו עבור סוגים שונים של חומרים פנימיים, גם הראינו כי GFP ו מולקולת ניאון מסיס במים קטן (uranine) יכולים להיות גלום Gvs.
Gravities הספציפי של מדיום פיזור מהימי הפנימי ואת בתמיסה מהימית החיצונית חייב להיות שנבחר בקפידה. עבור w / o תחליב כדי לזרז לתוך בתמיסה מימית החיצוני במהלך צנטריפוגה, המשקל הסגולי של המדיום פיזור מימית הפנימי חייב להיות גדול יותר מזה של בתמיסה מימית החיצוני. ניסינו להכין Gvs באמצעות פתרונות פנימיים וחיצוניים ללא סוכרים, אבל אנחנו לא השגנו Gvs בתנאים אלה, משום בתמיסה מהימית הפנימית לא הייתה מספיק מסה כדי לחצות את ההתערבות בין שני השלבים. אם יש הבדל הלחץ האוסמוטי גדול בין שני פתרונות, Gvs כי לזרז לתוך בתמיסה מימית החיצוני עשוי להתכווץ או קרע. לכן, הלחץ האוסמוטי בתוך ומחוץ Gvs חייב להיות שווה. כדי להשיג זאת, השתמשנו סוכרוז כפי מומס בפיזור וגלוקוז מהימיים הפנימיים כמו מומס בתמיסה מהימית החיצונית; סוכרים הן היו באותו ריכוז. מלח שניss = "Xref"> 22 והסוכר 23, 35, 38 שמשו למטרות כאלה, אבל סוכר בדרך כלל מועסק כי זה פחות רעיל ועוד מסיס מאשר מלח. עם זאת, אם סוכר יותר מדי מתווסף, Gvs שעלול לבוא במגע עם החלק התחתון של זכוכית המכסה וקריסה. ישנן מספר אסטרטגיות להימנעות זו. אסטרטגיה אחת היא להפחית את ההבדל הסגולי בין התמיסות מימיות הפנימיות וחיצוניות כך Gvs לזרז בתנאים קלים; במיוחד, supernatant של פיזור GV זירז ניתן להחליף עם פתרון זהה בתמיסה מימית פנימית כדי לצמצם את האפשרות של קרע שלפוחי ידי הדבקה על זכוכית המכסה כתוצאה הציפה. אסטרטגיה נוספת היא precoat הוא משקפי כיסוי עם סרט שומנים דק 29.
הכנת דגירה תקינה של התחליב הםחָשׁוּב. השתמשנו פרפין נוזלי כדי להכין את הפתרון השמן. מינרליים שמן 26, 31, 21 dodecane, 33, ו squalane 33, 39 גם משמשים לעתים קרובות כמו שמנים ממסים. מאחר וחומרים אלה משתנים משקל סגולי, צמיגות, ואת מתח הפנים, מספרים שונים של שלפוחית להיווצר גם כאשר אותם התנאים צנטריפוגה משמשים 33. כדי להשיג את השלפוחית עם תכונות היעד, זה הכרחי כדי לייעל את gravities ו viscosities הספציפיים של תמיסות מימיות הפנימיות וחיצוניות וכן הכנת acceleration.For צנטריפוגלי של שלב הנפט, דגירה חייבת להתרחש בטמפרטורה גבוהה בתוך יבש הסביבה כגון באינקובטור או סופג לחות. במחקר זה, אנו חממנו את פרפין הנוזל 80 ° C לפזר תוספת שומני molecules.In לחלוטין, התחליב צריךלהיות מוכן רק לפי הצורך ומיד צריך להיות נתון צנטריפוגה כי זה לא יציב רק אחרי שהוא מוכן ואת w / o טיפות הפתיל בקלות אחד לשני. התחליב ניתן להכין בכמויות גדולות על ידי sonication, vortexing, או קשה. עם זאת, באמצעות homogenizer מאפשר הכנה מהירה של כמויות גדולות של תחליב תחליב קל בשמן עם צמיגות גבוהה. כמו כן, חשוב כי התחליב להיות שכבתי על בתמיסה המימית החיצונית בעדינות במהירות ולאחר מכן מקורר על 4 מעלות צלזיוס. כדי לקצר את הזמן בין תחליב ו צנטריפוגה, מערכת בתמיסה מהימית-חיצוני שמן ניתן prechilled לפני אמולסיה מצוי בשכבה אותו, ואת המערכת כולה ניתן centrifuged אז immediately.If העכירות הלבנה מופיעה מהר יותר או לאט יותר מרגיל, המכנים homogenizer יש לשטוף ביסודיות כדי להסיר דטרגנטים ניקוי. בנוסף, לפני התחליב, הפתרון השמן, בתמיסה מימית פנימית, מתחלב חייב להיות returned לטמפרטורת החדר.
אצת צנטריפוגלי נכונה היא גם חשובה. על ידי centrifuging ב 18,000 x גרם, הצלחנו להכין Gvs עם חומר פנים בודד במארז בריכוז גבוה. כאשר אנקפסולציה של חומרים מרובים נדרש, עדיף להפחית את האצת צנטריפוגלי. לדוגמא, מערכת הרכבה תקטין encapsulating שבע תרכובות הושגה עם צנטריפוגה ב פחות מ 350 x g 35. במקרים בהם צנטריפוגה אינה רצויה, Gvs ניתן להשיג על ידי התאמת ריכוז סוכר או על ידי מזרז התחליב תחת השפעת המסה שלו עצמו 38, 40, 41.
השיטה דיווחה יש בזאת שתי מגבלות עיקריות. האחת היא כי מולקולות שמן (פרפין, במקרה הזה) יכול להיות solubilized בקרום GV, כפי שצויין על ידי Weitz הקבוצה 21. כאשר החדרת חלבון הממברנה לתוך קרום GV היא רצויה, את ההשפעות של מולקולות שמן שיתוף קיימת על החלבון יש לקחת בחשבון. המגבלה השנייה היא הווריאציה של שבר נפח. במחקר זה, אנו מעריכים כי נפח שברים של microspheres ב Gvs נע בין% בנפח 4-30; שברים נפח לא היו זהים שבר נפח של בתמיסה מימית הפנימי משמש להכנת GV. למרות שהצלחנו לתמצת microspheres ב Gvs בכל חלק נפח מספיק גבוה להסתכלות במיקרוסקופ, שיטה זו אינה מתאימה להכנת Gvs עם חלוקה שבר נפח אחידה. זה כבר דווח כי חלוקת נפח שברים microsphere משתנה במהלך צנטריפוגה 34.
שיטת צנטריפוגה תחליב w / o משמשת בדרך כלל להיווצרות Gvs המכיל חומרים כמוסים. עם זאת, דיווחים מעטים תיארו את pפיצוי של Gvs encapsulating חומרים microscale 34, 42. לאחרונה, רובוטים מולקולריים המכילים מכשיר ה- DNA במארז או התקן מולקולרי נבנו 43, 44. Gvs עם תאים הם הבחירה הראשונה עבור סוגים אלה של יישומים; ולכן, טכניקות, כשלנו, שיכול לשמש עבור encapsulating microspheres ו microspheres המגנטיים עם functionalization משטח המגוון ניתן צפוי להיות שימושי 44.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים טומוקו ימגוצ'י עבור ציור התמונה סכמטי באיור 1. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט Okazaki ORION המכון Okazaki עבור אינטגרטיבית Bioscience של theNational המכונים למדעי הטבע (מהנינג'ות); על ידי פרויקט מרכז אסטרוביולוגיה (לא AB281010.) של מהנינג'ות; על ידי גרנט ב- Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים (סידור דינמי מערכות biomolecular ליצירת פונקציות משולבות) מאגודת יפן לקידום המדע (JSPs) (לא 25,102,008.); על ידי גרנט ב- Aid למדענים צעירים (B) (כדי KK, לא 15K17850.) מ JSPs; andby מענק-in-Aid למחקר פעילותן של חברות ההזנק (כדי YN, לא. 15H06653) מ JSPs. תמיכה נוספת מסופקת על ידי מענק מטעם מכון נוגוצ'י, מענק מטעם קאו הקרן לאמנויות ומדעים, ומענק ממי Kurita וסביבה הקרן.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |