Summary

Mesure de<em> In vitro</em> Activité d'intégration du VIH-1 préintégration Complexes

Published: February 22, 2017
doi:

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

les protéines d'enveloppe du VIH-1 engagent récepteurs correspondants sur la surface de la cellule cible, ce qui conduit à la cellule d'origine virale fusion membranaire, suivie par la libération du noyau capside (CA) dans le cytoplasme. Par la suite, le virus de la transcriptase inverse (RT), dans le cadre d'un complexe du même nom nucléoprotéine appelée Reverse Transcription Complex (RTC), convertit le génome d'ARN simple brin viral dans une copie d'ADN double brin (vDNA). Cela conduit à la biogenèse d'un autre complexe de nucléoprotéine, appelé le complexe de pré-intégration (PIC), composée de la vDNA et des protéines virales associées et les facteurs de l'hôte. L'intégrase virale PIC-associé (IN) orchestrant l'intégration du vDNA dans l'ADN chromosomique de l'hôte dans un processus en deux étapes régulé temporellement et spatialement. D'abord, le processus IN extrémités 3 'du vDNA dans le cytoplasme et, en second lieu, après que le PIC trafique vers le noyau, il médie l'intégration du vDNA transformé dans l'ADN chromosomique. Les PICs isolésà partir de cellules cibles infectées de façon aiguë par le VIH-1 sont fonctionnelles in vitro, car ils sont compétents pour intégrer la vDNA associée à un ADN cible hétérologue ajouté de manière exogène. Dans des tests d'intégration in vitro telle base PIC ont considérablement contribué à délimiter les détails mécanistiques de l' intégration rétrovirale et à la découverte de inhibiteurs de l' IN. Dans ce rapport, nous élaborons sur un VIH-1 PIC test mis à jour qui utilise un imbriquée en temps réel Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) stratégie à base de mesure de l'activité d'intégration in vitro de PICs indigènes isolés.

Introduction

HIV-1 replication dans la cellule cible implique plusieurs étapes, de façon générale regroupées en deux phases: les événements précoces et tardifs. Les événements précoces commencent lorsque le VIH-1 de façon séquentielle se lie au récepteur de surface des cellules cibles CD4 et l' un des deux co-récepteurs (CCR5 ou CXCR4) 1. Par conséquent, la membrane fusible virus des cellules, et la capside virale (CA) de base est libérée dans le cytoplasme 2. Le noyau CA contient l'ARN viral génomique simple brin (ssRNA) et plusieurs protéines, à la fois virale et cellulaire à l'origine. Les protéines virales associées CA comprennent la transcriptase inverse (RT) et intégrase (IN), deux enzymes qui interviennent dans les étapes critiques pendant les événements précoces de la réplication virale. La RT et IN fonction dans le contexte des complexes de nucléoprotéine, à savoir la transcription inverse complexe (RTC) et le complexe de pré-intégration (PIC), respectivement 3, 4, 5 <sup>, 6. Les extrémités du génome viral de ssRNA terminal portuaire répétition (R) des éléments adjacents aux séquences U5 uniques (à l'extrémité 5 ') et U3 (à l'extrémité 3'). Le RTC convertit le ssRNA génome viral dans un (ds) copie d'ADN double brin (vDNA). Ce processus de transcription inverse se traduit également par une duplication des séquences U3 et U5, générant ainsi des longues répétitions terminales (LTR) aux deux extrémités de la vDNA 7, 8. Par la suite, IN PIC associé catalyse deux réactions biochimiques successives qui permettent l'intégration du vDNA dans le chromosome hôte 9, 10, 11. Tout d' abord, dans le cytoplasme, IN multimères s'engager les deux LTR et 12 cliver un dinucléotide à partir de chacune des extrémités 3 'terminales. Ce traitement génère l' extrémité 3 ' d' un groupe hydroxyle à chaque extrémité 3' (OH CA) de la vDNA.Ensuite, PIC trafique vers le noyau, dans lequel IN utilise le vDNA CA OH comme nucléophile pour couper les deux brins de l'ADN chromosomique en quinconce. Simultanément, se dissocie de façon coordonnée les deux extrémités du vDNA aux liaisons phosphodiester résultant sur des brins opposés de l'ADN chromosomique. Après cette étape de transfert de brin, la machinerie de la cellule hôte supprime les deux nucléotides non appariés aux extrémités 5 'de la vDNA et répare les lacunes simple brin qui en découlent à la jonction du site d'intégration. Les événements précoces aboutissent donc à la création d'une copie d'ADN intégré (provirus) du génome du VIH-1. Provirus fournit un environnement approprié pour l'expression des gènes viraux efficaces, ce qui déclenche des événements ultérieurs, y compris l'expression des protéines codées par le virus; assemblage du virus immature; et le bourgeonnement, la libération et la maturation dans des virions infectieux 13.

Purifié rétroviral IN recombinant est compétent pourréaliser, in vitro, les deux traitement et de transfert de brin activités 3'-terminales sur exogène ADN substrat LTR-like. Des études biochimiques utilisant de tels recombinant purifié IN ont révélé des aspects critiques de l' intégration vDNA 14, 15, 16, 17. Cependant, contrairement à une infection naturelle, cette réaction biochimique in vitro ne supporte pas l' intégration concertée des deux extrémités de l'ADN de substrat dans l'ADN cible. En revanche, les PIP rétrovirales isolées à partir de cellules infectées de façon aiguë intégration concertée des deux extrémités du vDNA endogène dans un ADN cible hétérologue. Cela a conduit à l'adoption généralisée et des améliorations ultérieures de Vitro Intégration (IVI) essais I n en utilisant PICs indigènes isolés.

Dans le premier essai rapporté IVI rétroviraux, des extraits cytoplasmiques provenant de cellules infectées par un recombinant murineVirus de la Leucémie (MLV) hébergeant le gène de E. coli SupF dans sa LTR a servi comme source d'activité IN et l'ADN d'un mutant de phage lambda défectueux dans la croissance lytique a été fourni de manière exogène comme l'ADN cible. l'intégration réussie de l'ADN recombinant MLV la copie dans l'ADN du phage et l'expression qui suit SupF conduit à la restauration de la capacité des phages recombinants de formation de plaques. Cependant, cette stratégie expérimentale est laborieuse et l'intégration de mesures d'une manière indirecte. Pour faire face à ces mises en garde, un test de fin marquage indirect basé blot-Sud, qui quantifie l'activité IVI PIC associée en tant que mesure de la vDNA endogène intégré dans bactériophage linéarisé exogène phiX174 ADN, a été mis au point 6, 7, 18. Bien que cette méthode fournit une mesure directe des événements d'intégration, des quantités relativement élevées de la préparation des PIC sont nécessaires, ce qui reste un défi techniqueeffort. Pour contourner cela, des tests basés sur la PCR imbriquées ne nécessitant que des quantités modestes de PICs ont été développés 4, 5, 19.

Dans ce rapport, nous décrivons une version mise à jour d'une PCR nichée à base in vitro conçu pour récapituler l'activité d'intégration du VIH-1 PIC médiée survenant au cours de l' infection naturelle. Cette méthode utilise les extraits cytoplasmiques des cellules cibles du VIH-1 infectées en tant que source d'activité PIC endogène, qui est mesurée à l'aide d'une polymérase en temps réel quantitative Chain Reaction (PCR quantitative). Les procédures d'isolement PICs et mesurer leurs activités d'intégration sont adaptées, avec des modifications, des protocoles publiés par le laboratoire Engelman 20. Dans ce procédé, l'activité d'intégration PIC associée est déclenchée en fournissant un ADN cible exogène linéaire 21, et les produits d'ADN résultant decette réaction d'intégration sont purifiés et utilisés comme matière de départ pour la quantification par PCR ultérieure. Dans le premier tour de PCR classique, les jonctions d'ADN viral cible sont amplifiés en utilisant des amorces appropriées. Dans le second tour qPCR, amorces LTR-spécifiques sont utilisés pour enrichir spécifiquement la population vDNA des produits de première ronde de PCR. S'il vous plaît voir la section de protocole pour une description détaillée de cette méthode.

Des études in vitro avec PICs rétroviraux ont permis des avancées significatives dans notre compréhension du mécanisme d'intégration de l' ADN rétroviral et dans le développement d'inhibiteurs IN. Sur la base de la récente focalisation accrue sur la cartographie du VIH-1 des sites d'intégration, déterminer le rôle des facteurs viraux et d'accueil du VIH-1 l'intégration et le développement de nouveaux médicaments antiviraux dans la lutte contre la résistance aux médicaments, nous envisageons un intérêt accru et l'utilisation généralisée des IVI essais , comme celle décrite dans le présent rapport. Ceci, à son tour, conduira àaméliorations futures dans la méthode, diversifiant ainsi la portée de ses applications.

Protocol

1. Production de virus Remarque: pour produire des titres élevés de VIH-1 infectieux, transfecter la lignée de rein embryonnaire humain (HEK), des cellules 293T avec un HIV-1 clone moléculaire infectieux en utilisant un réactif de transfection à base de dendrimères activés. Il a été observé que le procédé au phosphate de calcium de transfection donne des résultats comparables. Dans un niveau de biosécurité 2 (NSB2) laboratoire, graines 3 x 10 6 cellules …

Representative Results

Isolement du VIH-1 PICs Un schéma du protocole utilisé pour l'isolement du HIV-1 provenant de cellules PIP Sup-T1 infection aiguë est représenté sur la figure 1. Ce protocole est dérivé des méthodes décrites par Engelman et al. 19, 20. VIH-1 PICs sont complexes nucléoprotéine qui sont assemblés dans des cellule…

Discussion

Les analyses biochimiques de PICs rétrovirales ont fourni des informations critiques dans le mécanisme de l'intégration de l'ADN rétroviral. La mesure de l'activité d'intégration des PIC rétroviraux peut être obtenue par un essai de formation de plaque, l'analyse par transfert de Southern et emboîtée qPCR. La stratégie expérimentale de l' essai sur plaque est laborieuse et utilise une méthode indirecte pour mesurer l' intégration 6, <sup class=…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est en partie financé par des subventions DA024558, DA30896, DA033892 et DA021471 du NIDA / NIH sur CD. Nous reconnaissons également l'octroi G12MD007586 RCMI, le Vanderbilt CSTC accorder UL1RR024975, le Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA subvention U54 de RR026140 du NCRR / NIH, le MD007593 U54 de subvention du NIMHD / NIH, et le Tennessee CFAR subvention P30 AI110527.

Materials

Fetal bovine serum (FBS)

GIBCO/Invitrogen

10437-028

Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)

GIBCO/Invitrogen

10438-026

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)

GIBCO/Invitrogen

11995-065

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium

GIBCO/Invitrogen

11875-093

Phosphate buffered saline (PBS) (1X)

GIBCO/Invitrogen

20012-027

Trypsin-EDTA (0.25%)

GIBCO/Invitrogen

25200-056

Penicillin-Streptomycin solution (100x)

Cellgro/Mediatech

30-002-CI

HEK293T cells (293T)

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-3216

HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

114

PolyFect transfection reagent

Qiagen

301107

DNase

Calbiochem/Merckmillipore

260913

Immulon 2HB 96-well plates

Thermo Scientific

3455

Triton X-100

Sigma-Aldrich

T9284

ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

1513

ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)

Donor bovine serum

 Gibco/Invitrogen

16030074

Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.

Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.

Recombinant p24 protein

(Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)

Dr. Wesley Sundquist

HIV IgG

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

3957

Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate

Pierce/ThermoFisher

31412

TMB Microwell Peroxidase substrate system

KPL, Inc.

50-76-00

SupT1 cells

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-1942

HEPES pH 7.2-7.5

(ready-to-use solution)

GIBCO/Invitrogen

15630-080

Potassium chloride (KCl) solution

Sigma-Aldrich

60142

Magnesium chloride (MgCl2) solution

Sigma-Aldrich

M1028

Dithiothreitol (DTT)

Sigma-Aldrich

43815

Aprotinin

Sigma-Aldrich

A6106

Digitonin

Sigma-Aldrich

D141

RNase A

Invitrogen

12091-021

Sucrose

Sigma-Aldrich

S0389

phiX174 Replicative Form 1 DNA

Promega

D1531

PhiX174-F primer:

5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’

PhiX174-R primer:

5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

dNTP mix

Promega

U1515

Go Taq DNA Polymerase

Promega

M3005

Qiaquick gel extraction kit

Qiagen

28706

Ultrapure distilled water

Invitrogen

10977-015

Tris-EDTA (TE) buffer (100X)

Sigma-Aldrich

T9285

Sodium dodecyl sulphate (SDS)

Sigma-Aldrich

L3771

Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0

Sigma-Aldrich

E7889

Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)

Qiagen

19131

Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)

Sigma-Aldrich

P4557

Chloroform

Sigma-Aldrich

288306

Glycogen (5 mg/ml solution)

Ambion/Invitrogen

AM9510

Sodium acetate (3M, pH 5.2)

Sigma-Aldrich

57899

Ethanol

Sigma-Aldrich

E7023

First round LTR primer:

5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’)

First round phiX174 primer:

5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

Second round LTR-R primer:

5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’

Second round LTR-U primer:

5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’;

Second round Taqman probe:

 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC

CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’

Invitrogen and/or IDT-DNA

iQ Supermix

Bio-Rad

170-8862

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Balasubramaniam, M., Davids, B., Addai, A. B., Pandhare, J., Dash, C. Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes. J. Vis. Exp. (120), e54581, doi:10.3791/54581 (2017).

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