测量<em>体外</em> HIV-1 Preintegration配合物的整合活动
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
HIV-1包膜蛋白的接合靶细胞表面，这导致病毒细胞膜融合，随后通过释放病毒衣壳（CA）的芯的进入细胞质上的同源受体。接着，病毒逆转录酶（RT），如一个同名核蛋白复合物的一部分被称为反转录复合物（RTC），转换病毒单链RNA基因组中的双链DNA拷贝（VDNA）。这导致了另一个核蛋白复合物中的生物合成，称为集成预复合物（PIC），所述VDNA和相关病毒蛋白和宿主因素组成。在PIC相关病毒整合酶（IN）的编排一体化VDNA成在时间上和空间上调节两步骤过程宿主染色体DNA。首先，在IN处理VDNA的3'端在细胞质中，第二，在PIC投放到细胞核后，它介导的加工VDNA整合到染色体DNA中。太平洋岛国隔离从急性感染HIV-1的靶细胞在体外功能，因为它们有能力相关VDNA集成到一个外源添加的异源靶DNA。这种PIC-基于体外整合实验已显著贡献描绘逆转录病毒整合的机械细节和发现IN抑制剂。在这份报告中，我们在阐述一个更新的HIV-1检测PIC，它采用嵌套实时定量聚合酶链反应（定量PCR）为基础的策略，用于测量分离的天然太平洋岛国的体外整合活动。
Introduction
在靶细胞中HIV-1复制涉及多个步骤，大致分为两个阶段：早期和晚期的事件。当HIV-1顺序地结合靶细胞表面受体CD4和两个共同受体（CCR5或CXCR4）1的一个早期的事件开始。因此，该病毒细胞膜熔丝，病毒衣壳（CA）的芯被释放到细胞质2。在CA芯含有病毒基因组的单链RNA（ssRNA）和几种蛋白质，包括病毒和起源细胞。在CA相关病毒蛋白包括逆转录酶（RT）和整合酶（IN），在病毒复制的早期事件介导的关键步骤的两种酶。 RT和在核蛋白复合体，即反转录复合物（RTC）和一体化的预复合物（PIC），分别为3，4，5的上下文功能<SUP>，6。所述病毒ssRNA基因组海港末端重复（R）相邻的元件以特有的序列U5（在5'端）和U3（在3'端）的端部。 RTC的转换病毒ssRNA基因组中双链（DS）的DNA拷贝（VDNA）。此逆转录过程也导致U5和U3序列的重复，从而产生在VDNA 7,8的两端长末端重复序列（LTR）。接着，在PIC相关中催化两个顺序的生化反应，使所述VDNA的整合到宿主染色体9，10，11。首先，在细胞质中，在多聚体接合两者的LTR 12和从每个3'-末端的裂解二核苷酸。此3'末端加工在每个3'端的VDNA的（CA OH）产生羟基。接着，PIC投放到细胞核，其中IN使用VDNA CA OH作为亲核切断染色体DNA的两条链以交错的方式。同时，在协调拼接的VDNA两端在染色体DNA上的相反链所得到的磷酸二酯键。以下这个链转移步骤，所述宿主细胞机器在整合位点的连接点除去在VDNA的5'端和修理随后的单链缺口两个未配对核苷酸。因此，早期事件达到高潮与建立的HIV-1基因组的集成DNA拷贝（前病毒）。原病毒提供了高效的病毒基因表达，从而启动后的事件，包括病毒编码的蛋白质的表达的合适的环境;未成熟病毒的组装;而崭露头角，释放和成熟为感染性病毒体13。
纯化的重组逆转录病毒在有资格进行， 在体外 ，两个3'-末端加工和链转移活动外源提供的LTR状衬底的DNA。使用这样的纯化的重组中的生化研究已经揭示VDNA积分14，15，16，17的关键方面。然而，不同于在天然感染，这在体外生化反应不支持基板DNA导入靶DNA的两端的协调一致的集成。与此相反，从急性感染的细胞中分离逆转录病毒的PIC协调一致内源性VDNA两端整合到异源靶DNA。这导致了广泛的采用和I N体外集成（IVI）测定后续改进使用分离的天然照片。
在首次报道逆转录病毒的IVI测定法，从感染了重组小鼠细胞胞质提取物白血病病毒（MLV）窝藏在其LTR 大肠杆菌supF基因担任活动的源，和一个突变λ噬菌体缺陷在裂解生长作为目标的DNA外源提供的DNA中。重组MLV的DNA成功整合复制到噬菌体DNA和随后supF表达导致的重组噬菌体的噬斑形成能力的恢复。然而，该实验策略是一种间接的方式费力和措施集成。为了解决这样的警告，一个Southern印迹间接末端标记测定法，其中量化的PIC-相关联的IVI活性内源性VDNA纳入外源线性噬菌体phiX174的DNA的量度，被开发6，7，18。虽然这种方法提供了积分事件的直接量度，需要较高量的PIC的准备，这仍然是一个技术挑战性努力。为了规避这一点，只需要适量的PIC的巢式PCR为基础的测定法开发的4，5，19。
在这份报告中，我们描述的更新版本基于PCR技术在设计来概括自然感染过程中出现的HIV-1 PIC介导的整合活动体外方法嵌套。这种方法使用的HIV-1感染靶细胞的胞质提取物作为内源性的PIC活性的源，其与实时定量聚合酶链式反应（qPCR的）测量。隔离PIC和测量它们的整合活动的程序改编，经过修改，从由恩格尔曼实验室20发表协议。在该方法中，在PIC相关积分活性是通过提供外源的线性靶DNA 21，并从得到的DNA产物发起这种融合反应中纯化，并用作用于基于PCR的随后的量化的起始原料。在第一轮常规PCR，病毒靶DNA结是通过使用合适的引物扩增。在第二轮的qPCR，特定LTR-引物用于特异性富集来自第一轮PCR产物的VDNA人口。请参见该方法的详细描述的协议部分。
在用反转录病毒的PIC 体外研究已经导致显著进展中的逆转录病毒DNA整合机制的理解以及在抑制剂的开发。根据最近的更加注重映射HIV-1的整合位点，确定的病毒和宿主因子的HIV-1整合的作用，并朝向打击抗药性发展新的抗病毒药物，我们设想以增加的兴趣，并广泛使用的IVI测定的一样，本报告中所述的。这反过来会导致在该方法将来精炼，从而多样化其应用的范围。
Protocol
Representative Results
Discussion
逆转录病毒的PIC的生化分析提供了重要的见解逆转录病毒DNA整合的机制。逆转录病毒的PIC的融合活性的测定可通过空斑形成试验，Southern印迹分析，和嵌套的qPCR来实现。空斑试验的实验策略是费力并且利用测量积分6，7，18的间接方法。 Southern印迹的检测方法衡量直接集成，但需要较大量的PIC …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分由拨款DA024558，DA30896，DA033892和DA021471从NIDA / NIH到CD的支持。我们也承认RCMI批G12MD007586，范德比尔特CTSA授予UL1RR024975的梅哈里转化研究中心从NCRR / NIH，从NIMHD / NIH的U54补助MD007593，和田纳西CFAR补助P30 AI110527（MeTRC）CTSA补助U54 RR026140。
Materials
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Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
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Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
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Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
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HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
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PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
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DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
|
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
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Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
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Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
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Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
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Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
|
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
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PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
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dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
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Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
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Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
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Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
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First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
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Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
Riferimenti
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