Messung von<em> In Vitro</em> Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1-Replikation in der Zielzelle umfasst mehrere Schritte, im Großen und Ganzen gruppiert in zwei Phasen: frühe und späte Ereignisse. Die frühen Ereignisse beginnen , wenn HIV-1 sequentiell an den Oberflächenrezeptor Zielzelle bindet , CD4 und einem der beiden Co-Rezeptoren (CCR5 oder CXCR4) ^1. Folglich wird die Virus-Zellmembranen verschmelzen, und das virale Capsid (CA) Kern in das Zytoplasma ² freigegeben. Die CA Kern enthält die virale genomische einzelsträngige RNA (ssRNA) und mehrere Proteine, sowohl viralen und zellulären Ursprungs. Die CA-assoziierten viralen Proteine ​​umfassen Reverse Transkriptase (RT) und Integrase (IN), zwei Enzyme, die während der frühen Ereignisse in der viralen Replikation kritischen Schritte vermitteln. Die RT und IN – Funktion in Zusammenhang mit Nucleoprotein – Komplexe, nämlich die reverse Transkription Complex (RTC) und das Präintegrationskomplexes (PIC), die jeweils ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Die Enden des viralen Genoms ssRNA Hafen terminal repeat (R) Elemente benachbart zu der einzigartigen Sequenzen U5 (am 5'-Ende) und U3 (am 3'-Ende). Die RTC wandelt das virale ssRNA-Genom in eine doppelsträngige (ds) DNA-Kopie (vDNA). Diese umgekehrte Transkriptionsprozess resultiert auch in Duplizierung der U5 und U3 – Sequenzen, so lange terminale Wiederholungen (LTR) an beiden Enden der vDNA ^{7, 8} zu erzeugen. Anschließend katalysiert das PIC-assoziiertes in zwei aufeinanderfolgenden biochemischen Reaktionen, die die Integration der vDNA in das Wirtschromosom ^{9, 10, 11} ermöglichen. Zuerst wird im Zytoplasma, IN Multimere Eingriff beide LTRs ¹² und ein Dinukleotid aus jeder der 3'-terminalen Enden abzuspalten. Diese 3'-End – Verarbeitung erzeugt an jedem 3'-Ende (CA _OH) der vDNA eine Hydroxylgruppe.Als nächstes Verkehre PIC an den Kern, wobei in der vDNA CA _OH als Nucleophil verwendet beide Stränge der chromosomalen DNA in einer gestaffelten Art und Weise zu schneiden. Gleichzeitig Spleiße IN koordinativ an beiden Enden der vDNA der resultierenden Phosphodiesterbindungen auf gegenüberliegenden Stränge der chromosomalen DNA. Im Anschluss an diese Strangtransferschritt entfernt die Wirtszelle Maschinen die beiden ungepaarten Nukleotide am 5'-Enden der vDNA und repariert die folgenden einsträngige Lücken an der Kreuzung von der Integrationsstelle. Die frühen Ereignisse also mit der Einrichtung eines integrierten DNA-Kopie (Provirus) des HIV-1-Genoms gipfeln. Das Provirus stellt eine geeignete Umgebung für die effiziente virale Genexpression, die einschließlich der Expression der Virus-kodierten Proteinen spätere Ereignisse initiiert; Montage des unreifen Virus; und Knospung, Release und Reifung in infektiöse Virionen ^13.

Gereinigte rekombinante retrovirale IN ist zuständigdurchzuführen, in vitro, beide 3'-End – Verarbeitung und Strangtransferaktivitäten auf exogen zugeführt LTR artiges Substrat – DNA. Biochemische Untersuchungen so gereinigte rekombinante bei der Verwendung haben ergeben , kritische Aspekte der vDNA Integration ^{14, 15, 16, 17.} Jedoch anders als in natürlichen Infektion, diese in vitro biochemische Reaktion unterstützt nicht abgestimmten Integration beider Enden der Substrat – DNA in das Ziel – DNA. Im Gegensatz dazu integrieren Retrovirus PICs isoliert aus akut infizierten Zellen concertedly beide Enden des endogenen vDNA in heterologe Ziel-DNA. Dies führte zu der weit verbreiteten Annahme und nachfolgende Verfeinerungen von I n – vitro – Integration (IVI) Assays isoliert nativen PICs mit.

In der ersten berichteten retroviralen IVI-Assay, Zytoplasmaextrakte von Zellen mit einem rekombinanten Mäuse infiziertLeukemia Virus (MLV) , um das E. coli supF – Gen in seiner LTR beherberge diente als Quelle der IN – Aktivität und der DNA eines mutierten Lambda – Phagen – defekt in das lytische Wachstum wurde exogen als die Ziel – DNA zugeführt. Erfolgreiche Integration der rekombinanten DNA MLV Kopieren in die Phagen-DNA und die Expression supF anschließenden führte zur Wiederherstellung der Plaque-bildenden Fähigkeit der rekombinanten Phagen. Allerdings ist diese experimentellen Strategie ist mühsam und Maßnahmen Integration in indirekter Weise. Um solche Einschränkungen, ein Southern – Blot-basierte indirekte Endmarkierung Assay adressieren, die die PIC-assoziiertes IVI Aktivität als Maß für das endogene vDNA in exogene linearisierte Bakteriophage phiX174 – DNA integriert quantifiziert wurde ^{6 entwickelt, 7, 18.} Obwohl dieses Verfahren ein direktes Maß der Integrationsereignisse liefert, relativ hohe Mengen an PIC Herstellung erforderlich sind, was eine technisch anspruchsvolle bleibtbemühen. Um dies zu umgehen, Nested-PCR – basierte Assays erfordern nur geringe Mengen an PICs wurden ^{4, 5 entwickelt, 19.}

In diesem Bericht beschreiben wir eine aktualisierte Version von einer verschachtelten PCR-basierten In – vitro – Methode entwickelt , um die HIV-1 – PIC-vermittelte Integration Aktivität zu rekapitulieren während einer natürlichen Infektion auftreten. Diese Methode verwendet die zytoplasmatischen Extrakten von HIV-1-infizierten Zielzellen als eine Quelle für endogene PIC-Aktivität, die mit einem quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gemessen wird. Die Verfahren für die PICs zu isolieren und ihre Integrationsaktivitäten Messung angepasst sind, mit Modifikationen, von Protokollen , die vom Engelman Labor veröffentlicht ^20. In diesem Verfahren wird die PIC-assoziiertes Integrations Aktivität initiiert durch eine exogene lineare Ziel – DNA ²¹ bietet, und die DNA – Produkte ausDiese Integrationsreaktion werden gereinigt und als Ausgangsmaterial für die nachfolgende PCR-basierte Quantifizierung verwendet. In der ersten Runde konventionellen PCR, die viral-Ziel-DNA-Übergänge unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert. In der zweiten Runde qPCR, LTR-spezifische Primer verwendet werden, um spezifisch die vDNA Bevölkerung aus der ersten Runde der PCR-Produkte bereichern. Bitte beachten Sie die Protokollabschnitt für eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens.

In – vitro – Studien mit retroviralen PICs haben zu erheblichen Fortschritten im Verständnis des Mechanismus der retroviralen DNA – Integration und in der Entwicklung von IN Inhibitoren geführt. Basierend auf der jüngsten verstärkten Fokus auf Mapping-HIV-1-Integrationsstellen, die Rolle von viralen und Wirtsfaktoren in HIV-1-Integration zu bestimmen und die Entwicklung neuer antivirale Medikamente gegen Arzneimittelresistenz Bekämpfung erwarten wir ein verstärktes Interesse an und weit verbreiteten Einsatz von IVI-Assays , wie die in diesem Bericht beschrieben ein. Dies wiederum, führt zuZukunft Verfeinerungen bei dem Verfahren Diversifizierung dadurch den Umfang seiner Anwendungen.