Meting van<em> In Vitro</em> Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

HIV-1 replicatie in de doelcel omvat meerdere stappen, lijnen ingedeeld in twee fasen: vroege en late events. De vroege gebeurtenissen beginnen als HIV-1 sequentieel aan het doelwit bindt celoppervlak receptor CD4 en één van de twee co-receptoren (CCR5 of CXCR4) ^1. Bijgevolg is de virus-celmembranen zekering en het virale capside (CA) kern vrij in het cytoplasma ^2. De CA kern bevat het virale genoom enkelstrengs RNA (ssRNA) en verscheidene eiwitten, zowel virale als cellulaire oorsprong. De CA-geassocieerde virale eiwitten omvatten Reverse Transcriptase (RT) en integrase (IN), twee enzymen die kritische stappen bemiddelen tijdens vroege gebeurtenissen in de virale replicatie. De RT en IN functie in de context van nucleoproteïne complexen, namelijk de reverse transcriptie complex (RTC) en het pre-integratie complex (PIC), respectievelijk ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. De uiteinden van het virale genoom ssRNA haven terminal repeat (R) elementen naast de unieke sequenties U5 (aan het 5 'uiteinde) en U3 (aan het 3' uiteinde). De RTC zet de virale ssRNA genoom in een dubbelstrengs (ds) DNA-kopie (vDNA). Dit reverse transcriptieproces leidt ook tot verdubbeling van de U5 en U3 sequenties, waardoor het genereren van lange terminale herhalingen (LTR) aan beide uiteinden van het vDNA ^{7, 8.} Vervolgens de PIC-geassocieerde IN katalyseert twee opeenvolgende biochemische reacties die de integratie van het vDNA mogelijk in het gastheer chromosoom ^{9, 10, 11.} Eerst, in het cytoplasma, IN multimeren grijpen zowel LTR ¹² en klieven een dinucleotide van elk van de 3'-uiteinden. Deze 3'-end verwerking genereert een hydroxylgroep aan beide 3'-uiteinde (CA _OH) van het vDNA.Vervolgens PIC traffics naar de kern, waarbij in gebruik het vDNA CA _OH als nucleofiel op beide strengen van het chromosomale DNA geknipt in een versprongen wijze. Tegelijkertijd IN splits gecoördineerd beide uiteinden van het vDNA de resulterende fosfodiesterbindingen op tegenoverliggende strengen van het chromosomale DNA. Na deze strand transfer stap, de gastheercelmachinerie verwijdert de twee ongepaarde nucleotiden aan de 5 'einden van het vDNA en herstelt de daaropvolgende enkelstrengige openingen op de kruising van de integratieplaats. De vroege gebeurtenissen dus culmineren met de oprichting van een geïntegreerde DNA-kopie (provirus) van het HIV-1-genoom. Het provirus verschaft een geschikte omgeving voor efficiënte virale genexpressie, welke latere gebeurtenissen, zoals de expressie van het virus gecodeerde eiwitten initieert; assemblage van de onrijpe virus; en ontluikende, release, en rijping tot infectieuze virions ^13.

Gezuiverd recombinant retrovirale IN bevoegd isuit te voeren, in vitro, zowel 3'-end verwerking en strand transfer activiteiten op exogeen geleverd LTR-achtige substraat DNA. Biochemische studies met dergelijke gezuiverde recombinant IN zijn kritische aspecten van vDNA integratie ^{14, 15, 16, 17} geopenbaard. Anders dan in natuurlijke infectie, het in vitro biochemische reactie ondersteunt onderling integratie van beide uiteinden van het substraat DNA in het doelwit DNA. Daarentegen retrovirale PICs geïsoleerd uit acuut geïnfecteerde cellen eensgezind beide uiteinden van de endogene vDNA integreren heterologe doelwit DNA. Dit leidde tot de wijdverbreide invoering en daaropvolgende verfijningen van I n Vitro Integratie (IVI) testen met behulp van geïsoleerde inheemse zuivere intercommunales.

In de eerste gerapporteerde retrovirale IVI assay, cytoplasmatische extracten uit cellen geïnfecteerd met recombinant MuisLeukemie virus (MLV) die het op E. coli supF gen in de LTR aan de grondslag van de activiteit en het DNA van een mutant defectief in lambda faag lytische groei exogeen geleverd als het doelwit DNA. Succesvolle integratie van het recombinante DNA MLV kopiëren in de faag-DNA en de daaruit voortvloeiende supF expressie leidde tot herstel van de-plaque-vormende vermogen van de recombinante fagen. Echter, deze experimentele strategie is arbeidsintensief en maatregelen integratie op een indirecte manier. Dergelijke restricties pakken, een Southern-blot gebaseerde indirecte eindlabeling assay, die de PIC-geassocieerde IVI activiteit als maat voor de endogene vDNA geïntegreerd exogeen gelineariseerde DNA bacteriofaag PhiX174 kwantificeert ontwikkeld ^{6, 7, 18.} Hoewel deze werkwijze een directe maat integratiegebeurtenissen, relatief grote hoeveelheden PIC voorbereiding vereist, die nog een technisch uitdagendetrachten. Om dit te omzeilen, geneste PCR-gebaseerde testen die slechts geringe hoeveelheden PICs ontwikkeld ^{4, 5, 19.}

In dit verslag we een bijgewerkte versie van beschrijven een geneste PCR-gebaseerde in vitro werkwijze ontwikkeld om de HIV-1 PIC-gemedieerde integratie activiteit tijdens natuurlijke infectie recapituleren. Deze methode gebruikt de cytoplasmatische extracten van HIV-1-geïnfecteerde doelcellen als bron van endogene PIC activiteit, gemeten met real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). De procedures voor het isoleren van zuivere intercommunales en het meten van de integratie activiteiten worden aangepast, met wijzigingen, van protocollen, gepubliceerd door de Engelman laboratorium ^20. In deze werkwijze wordt de PIC-geassocieerde integratie geïnitieerd door een exogeen lineaire doel DNA ²¹ en het DNA verkregen productenDeze integratie reactie worden gezuiverd en gebruikt als uitgangsmateriaal voor daaropvolgende PCR-kwantificering. In de eerste ronde conventionele PCR, wordt het virale DNA-doelwit knooppunten geamplificeerd met gebruikmaking van geschikte primers. In de tweede ronde qPCR, LTR-specifieke primers worden gebruikt om specifiek verrijken vDNA populatie van de eerste ronde PCR producten. Zie het protocol gedeelte voor een gedetailleerde beschrijving van deze methode.

In vitro onderzoeken met retrovirale PICs hebben geleid tot significante vooruitgang in ons begrip van het mechanisme van DNA retrovirale integratie en in de ontwikkeling van remmers in. Op basis van de recent toegenomen aandacht voor het in kaart brengen van HIV-1 integratie sites, het bepalen van de rol van virale en gastheer factoren in HIV-1 integratie en de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen aan de bestrijding van resistentie tegen geneesmiddelen, overwegen we een toenemende belangstelling voor en het wijdverbreide gebruik van IVI assays , zoals die in dit rapport beschreven. Dit op zijn beurt zal leiden tottoekomstige verfijningen in de werkwijze, waardoor de omvang van de toepassingen te diversifiëren.