の測定<em>インビトロ</em> HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド（CA）コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素（RT）は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写（RTC）は、二本鎖DNAコピー（vDNA）へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体（PIC）は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ（IN）は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 '末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイで PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。
Introduction
初期および後期のイベント：標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体（CCR5またはCXCR4）1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド（CA）コアが細胞質2に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素（RT）及びインテグラーゼ（IN）、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写（RTC）とプレインテグレーション複合体（PIC）の文脈で機能IN、3、4、5 <SUP>、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート（R）ユニークな配列の（5時U5 '末端）および（3時U3'末端）に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖（ds）DNAコピー（vDNA）へのウイルスのssRNAゲノムを変換します。この逆転写プロセスは、従ってvDNA 7,8の両端の長い末端反復（LTR）を生成し、U5及びU3配列の重複をもたらします。その後、PIC-関連INは宿主染色体9、10、11にvDNAの統合を可能にする2つの連続生化学反応を触媒します。まず、細胞質内で、多量体の両方のLTR 12に係合および3 '末端のそれぞれからジヌクレオチドを切断します。この3 '末端の処理は、各3'末端vDNAの（CA OH）にヒドロキシル基を生成します。INは千鳥状に染色体DNAの両方の鎖を切断する求核剤としてOH vDNA CAを使用する、請求次に、PICは、核に入稿。同時に、INは協調染色体DNAの反対の鎖上に得られたリン酸ジエステル結合にvDNAの両端を継ぎ。この鎖の転写工程に続いて、宿主細胞機構は、5 'vDNAの両端と修理に2つの不対ヌクレオチド組み込み部位の接合部に続く一本鎖ギャップを削除します。初期の事象は、このようにHIV-1ゲノムの統合されたDNAコピー（プロウイルス）の設立で絶頂に達します。プロウイルスは、ウイルスにコードされたタンパク質の発現を含む、後のイベントを、開始し、効率的なウイルス遺伝子の発現に適した環境を提供します。未成熟ウイルスのアセンブリ。そして、リリース、および感染性ビリオン13への成熟出芽。
精製された組換えレトロウイルスINはに有能ですin vitroで 、行って、両方の3 '末端プロセシングおよび鎖移転活動は、上の外因LTRのような基質DNA供給します。このような精製された組換えINを用いて生化学的研究は、vDNA統合14、15、16、17の重要な側面を明らかにしました。しかし、自然感染とは異なり、このインビトロ生化学反応は、標的DNAに基質DNAの両端の協調統合をサポートしていません。これとは対照的に、急性感染細胞から単離されたレトロウイルスのPICは、協奏異種標的DNAの中に内在性vDNAの両端を統合します。これは、単離された天然のPICを使って広く採用し、I nはインビトロインテグレーション（IVI）アッセイのその後の改良につながりました。
最初に報告されたレトロウイルスIVIアッセイでは、細胞からの細胞質抽出物は、組換えマウスに感染させましたそのLTRに大腸菌supF遺伝子を有する白血病ウイルス（MLV）は、IN活動の源を務め、および溶菌成長の欠損変異体ラムダファージのDNAは、外因的に標的DNAとして供給しました。組換えMLV DNAの統合を成功さは、ファージDNAにコピーして、その後のsupF式は、組換えファージのプラーク形成能力の回復につながりました。しかし、この実験的な戦略は面倒であり、間接的な方法で統合を測定します。このような警告に対処するために、vDNAは外因性の線形化バクテリオphiX174 DNAに組み込まれ、内因性の尺度としてPIC関連IVI活動を定量化するサザンブロットベースの間接末端標識アッセイは、18、7、6開発されました。この方法は、組込み事象の直接的な測定を提供するが、PICの調製の比較的高い量は技術的に困難なままである、必要とされます努力。これを回避するには、写真のわずかな量を必要とするネストされたPCRベースのアッセイは、19 5、4開発されました。
この報告書では、我々は、in vitroの方法で 、ネストされたベースのPCRの更新バージョンを記述自然感染時に発生するHIV-1 PIC媒介統合アクティビティを再現するために考案しました。この方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて測定された内因性のPIC活性の供給源として、HIV-1に感染した標的細胞の細胞質抽出物を使用します。 PICを単離し、それらの統合の活動を測定するための手順は、エンゲルマンの実験室20によって発行されたプロトコルから、修正を加えて、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、外因性の直鎖標的DNA 21から得られたDNA産物を提供することによって開始されますこの統合化反応を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。この方法の詳細な説明のためのプロトコルのセクションを参照してください。
レトロウイルスのPICを用いたin vitroの研究では、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムの理解にとINの阻害剤の開発に大きな進歩につながっています。 HIV-1の統合におけるウイルスと宿主因子の役割を決定し、薬剤耐性との闘いに向けて新たな抗ウイルス薬の開発、マッピング、HIV-1の統合サイトでの最近の増加の焦点に基づいて、我々は、IVIアッセイの関心の高まりや広範な使用を想定します、この報告書に記載のものなどがあります。これは、今度は、につながりますそれによって、そのアプリケーションの範囲を多様化する方法で将来の改良、。
Protocol
Representative Results
Discussion
レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合6、7、18を?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、CDにNIDA / NIHからの助成金DA024558、DA30896、DA033892、およびDA021471によってサポートされています。また、ヴァンダービルトCTSAはUL1RR024975、NCRR / NIH、NIMHD / NIHからU54グラントMD007593、およびテネシーCFARグラントP30のAI110527からMeharryトランスレーショナルリサーチセンター（MeTRC）CTSAグラントU54のRR026140を付与し、RCMIグラントG12MD007586を認めます。
Materials
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Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
|
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
|
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
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HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
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PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
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DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
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ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
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Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
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Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
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Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
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Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
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HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
|
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
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dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
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Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
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Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
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First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
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Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
Riferimenti
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
- Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
- Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
- Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
- Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
- Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
- Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration–mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
- Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
- Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
- Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
- Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
- Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
- Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
- Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
- Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
- Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
- Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).
