측정<em> 체외</em> HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
HIV-1 외피 단백질은 세포질로의 바이러스 캡시드 (CA) 코어의 박리 하였다 바이러스 세포 막 융합을 유도하는 표적 세포의 표면에 동족 수용체 결합. 이어서, 바이러스 성 역전사 효소 (RT)를하는 딴 핵 단백질 복합체의 일부로서 복합 역전사 (RTC)를 이중 – 가닥 DNA 카피 (vDNA)에 바이러스의 단일 가닥 RNA 게놈을 변환 불린다. 이것은 다른 핵 단백질 복합체의 생물 발생에 이르게 상기 vDNA과 관련된 바이러스 단백질, 숙주 인자 이루어지는 사전 통합 복합체 (PIC)를 불린다. PIC는 관련 바이러스 인테그라 제 (IN)은 시간적 및 공간적으로 조절 두 단계에서 호스트 염색체 DNA 내로 vDNA의 통합을 조정한다. 우선, IN은 PIC의 핵 트래 피킹 후에는 염색체 DNA 내로 통합 처리 vDNA을 매개, 둘째, 세포질에서 vDNA의 3 '말단을 처리하고. 찍어 절연그들이 이종 외생 첨가 타겟 DNA에 관련된 vDNA를 통합하는 능력이 급격 같이 HIV-1 감염 표적 세포에서 시험 관내 기능이다. 이러한 PIC 기반 체외 통합 분석에서 크게 레트로 바이러스 통합의 기계적인 세부 사항을 서술 및 억제제 년에 발견에 기여했다. 이보고에서는 절연 기본 찍어 관내 통합 활동을 측정하기위한 중첩 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 기반 전략을 채택 업데이트 HIV-1 PIC 분석에 상세히.
Introduction
초기와 후기 이벤트 : 표적 세포에서 HIV-1 복제는 크게 두 단계로 구분 여러 단계를 포함한다. HIV-1을 순차적으로 표적 세포 표면 수용체 CD4 및 두 개의 공동 수용체 (CCR5 또는 CXCR4 1) 중 하나에 결합 할 때 초기 이벤트는 시작한다. 따라서, 바이러스 세포막 퓨즈 및 바이러스 캡시드는 (CA) 코어는이 세포질로 방출된다. 칼슘 코어는 바이러스와 기원 세포 모두 바이러스 게놈의 단일 가닥 RNA (ssRNA) 및 여러 가지 단백질을 포함하고 있습니다. 칼슘 – 관련 바이러스 성 단백질은 역전사 효소 (RT) 및 인테그라 (IN), 바이러스 복제의 초기 발생시 중요한 단계를 매개이 효소를 포함한다. 역전사 및 핵 단백질 복합체, 즉 역전사 착체 (RTC) 및 사전 통합 복합체 (PIC)는 각각 3, 4, 5의 문맥 함수 IN <SUP> 6. "(말 3에서) (끝 U3 바이러스 ssRNA 게놈 항구 터미널 반복 (R) 5시) '고유 시퀀스 U5에 인접 요소의 끝. RTC는 이중 가닥 (DS) DNA 사본 (vDNA)에 바이러스 ssRNA 게놈 변환합니다. 이 역전사 과정은 따라서 vDNA (7, 8)의 양단의 긴 말단 반복 (LTR)을 생성하는 U5 및 U3 서열의 중복을 초래한다. 이어서, PIC 관련 IN 호스트 염색체 9, 10, 11로 vDNA의 통합을 가능하게 두 개의 연속 생화학 적 반응을 촉매한다. 우선, 세포질, 다량 모두의 LTR (12)와 결합 및 3'- 말단의 각각으로부터 뉴클레오티드를 절단. 이것은 3'- 말단 처리가 각 3'- 단부 vDNA의 (CA OH)에 수산기를 생성한다.IN은 지그재그 방식으로 염색체 DNA의 두 가닥을 절단하는 친핵체로서 오 vDNA CA를 사용하는 것을 특징이어서, PIC는 핵 트래 피킹. 동시에, IN은 배위 염색체 DNA의 반대쪽 가닥에 생성 된 포스 포디 에스테르 결합에 vDNA의 양 단부를 접합한다. 이 스트랜드 전사 공정 후, 숙주 세포 기계 통합 사이트의 교차점에서 5 '를 vDNA의 단부 및 수리 계속되는 본쇄 갭의 2 개의 비 결합 (unpaired) 뉴클레오타이드를 제거한다. 초기 이벤트는 따라서 HIV-1 게놈의 통합 DNA 사본 (프로 바이러스)의 설립과 함께 절정에 달하다. 프로 바이러스는 바이러스 – 인 코드 된 단백질의 발현을 포함하여 이후의 이벤트를 시작 효율적인 바이러스 유전자 발현에 적합한 환경을 제공하고; 미성숙 바이러스의 조립; 감염성 비리 (13)에 신진, 릴리스 및 성숙.
정제 된 재조합 레트로 바이러스의 IN은에 능력이시험관 내에서, 수행, 모두 3'- 말단 처리 및 가닥 전송 활동에 외생 적 LTR 같은 기판 DNA 제공. 이러한 정제 된 재조합의 IN을 사용하여 생화학 연구 vDNA 통합 14, 15, 16, 17의 중요한 측면을 계시했다. 그러나, 자연 감염과는 달리,이 시험 관내 생화학 적 반응은 표적 DNA에 기판 DNA의 양 단부의 공동의 통합을 지원하지 않는다. 대조적으로, 심하게 감염된 세포로부터 단리 레트로 찍어 concertedly 이종 대상 DNA로 내인성 vDNA의 양단을 통합한다. 이것은 고립 된 원시 사진을 사용하여 널리 채택 및 I n은 체외 통합 (IVI) 분석의 후속 개선되었다.
처음에 레트로 바이러스 IVI 분석, 재조합 쥐에 감염된 세포로부터 세포질 추출물을보고그 LTR의 대장균 supF 유전자 형질 백혈병 바이러스 (MLV)는 IN 활성 소스 및 용균 성장 결함이 외생 대상 DNA로 공급 하였다 돌연변이 람다 파지 DNA 역임. 재조합 MLV DNA의 성공적인 통합은 파지 DNA에 복사하고 supF 다음의 표현은 재조합 파지의 플라크 형성 능력의 복원되었다. 그러나이 실험 전략은 간접적 인 방식으로 힘들고 조치 통합이다. 이러한주의 사항을 해결하기 위하여, 외인성 선형 박테리오 phiX174 DNA에 통합 내인성 vDNA의 척도로서 PIC 관련 IVI 활성을 정량화 서던 블롯 기반 간접 단부 라벨링 분석은, 18 (7), (6)을 개발 하였다. 이 방법은 통합 이벤트의 직접적인 측정을 제공하지만, PIC 제제의 상대적으로 높은 양의 기술적 도전 유지하는 필요노력. 이 문제를 회피하기 위해, PICS는의 적당한 양을 필요로하는 중첩 된 PCR 기반의 분석은, 19 (5), 4 개발되었다.
이 보고서에서 우리는의 업데이트 된 버전을 설명 중첩 된 자연 감염시 발생하는 HIV-1 PIC 매개 통합 활동을 요점을 되풀이하기 위해 고안 체외 방법에서 PCR 기반. 이 방법은 실시간 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로 측정 PIC 내인성 활성 소스로서 HIV-1 감염 표적 세포의 세포질 추출물을 사용한다. 자신의 통합 활동을 사진을 분리하고 측정하기위한 절차는 Engelman 실험실 (20)에 의해 출판 프로토콜에서, 수정과, 적응하고 있습니다. 이 방법에서, PIC 관련된 통합 활동 외인성 선형 표적 DNA (21)로부터 생성 된 DNA의 제품을 제공함으로써 개시된다이러한 통합 반응으로 정제 이후 PCR 기반 정량 용 원료로서 사용된다. 제 1 라운드 PCR 통상적으로, 바이러스 표적 DNA 접합은 적절한 프라이머를 사용하여 증폭된다. 두 번째 라운드에서 qPCR에가, LTR 특정 프라이머는 특히 1 라운드 PCR 제품에서 vDNA 인구를 풍부하게하는 데 사용됩니다. 이 방법에 대한 자세한 설명을위한 프로토콜 섹션을 참조하십시오.
레트로 바이러스 찍어와 시험관 연구에서 레트로 바이러스 DNA 통합의 메커니즘에 대한 우리의 이해와 IN 억제제의 개발에 상당한 발전을 주도하고있다. HIV-1 통합 바이러스 및 호스트 요인의 역할을 결정하고, 약물 내성 퇴치를 향해 새로운 항 바이러스 약물을 개발, 매핑 HIV-1 통합 사이트에서 최근 증가 초점을 바탕으로, 우리는 IVI 분석의 증가 된 관심과 광범위한 사용을 직시 이 보고서에 설명 된 것과 같은. 이 차례로 이어질 것상기 방법은 향후 개선함으로써, 그 응용 범위를 다양.
Protocol
Representative Results
Discussion
레트로 바이러스 PICS는의 생화학 적 분석은 레트로 바이러스 DNA 통합의 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 레트로 바이러스 찍어 통합 활성 측정은 플라크 형성 분석법, 서던 블롯 분석, 및 중첩 qPCR에 의해 달성 될 수있다. 플라크 분석의 실험적 전략은 힘든이고 통합 6, 7, 18를 측정하는 간접 방법을 이용한다. ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 CD에 NIDA / NIH 보조금 DA024558, DA30896, DA033892 및 DA021471에 의해 지원됩니다. 우리는 또한 RCMI 부여 G12MD007586을 인정, 밴더빌트 CTSA는 UL1RR024975을 부여의 Meharry 중개 연구의 중앙에 NCRR / NIH의 NIMHD / NIH에서 U54 그랜트 MD007593, 그리고 테네시 CFAR 보조금 P30의 AI110527에서 (MeTRC) CTSA 부여 U54의 RR026140.
Materials
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Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
|
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
|
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
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HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
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PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
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DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
|
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
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Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
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Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
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Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
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Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
|
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
|
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
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|
dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
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Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
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Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
|
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
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Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
Riferimenti
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