液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

水溶性代謝産物は、低分子の中間体であり、必須の細胞プロセスに寄与する代謝産物です。これらの進化的に保存されたプロセスには、栄養素の使用可能エネルギーへの変換、高分子の合成、細胞増殖およびシグナル伝達、細胞周期制御、遺伝子発現調節、ストレス応答、代謝の翻訳後調節、ミトコンドリア機能の維持、静脈細胞密売、オートファジー、細胞老化、および調節細胞死^1、2、3が含まれる。

水溶性代謝産物のこれらの本質的な役割の多くは、出芽酵母S.cerevisiae^{1、3、4、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22}の研究によって発見されています。この単細胞真核生物は、高度な生化学的、遺伝的、および分子生物学的解析^{23、24、25、26}へのアメナビリティによる細胞プロセスに水溶性代謝物が寄与する解剖機構を解剖するための有用なモデル生物である。非標的メタボロミクスのLC-MS法は、出芽酵母^{3、18、22、27}における水溶性代謝産物の役割を研究するために使用されてきたが^、この種の分析では、その汎用性、堅牢性、感度、およびこれらの代謝産物の異なる構造異性体と立体異性体形態を区別する能力の向上が必要である。

近年、非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法を生体内の水溶性代謝産物のプロファイリングに適用する際の大きな進歩が顕著である。しかし、この方法論を使用する上での多くの課題は、2、28、29、30、31、32、33、34、35、36のままです。これらの課題には、次のようなものがあります。まず、多くの水溶性代謝産物の細胞内濃度が、現在使用されている方法に対する感受性の閾値を下回る。第二に、代謝活性の改善の効率が低すぎると、細胞内代謝産物の焼入れ関連細胞漏出の程度は、現在の方法では高すぎる。したがって、現在使用されている水溶性代謝産物の細胞内濃度を過小評価する方法。第三に、既存の方法では、特定の代謝物の構造異性体(すなわち、同じ化学式を持つ分子が原子結合性が異なる分子)や立体異性体(すなわち、同じ化学式と原子結合性を有する分子)を区別することはできません。これにより、現在使用されているメソッドによる特定の代謝物の正しい注釈がなくなります。第4に、親イオン(MS1)と二次イオン(MS2)の既存の質量スペクトルオンラインデータベースは不完全です。これは、現在のメソッドの助けを借りて生成された未加工の LC-MS/MS データを使用して、特定の代謝産物の正しい識別と定量に影響します。第五に、既存の方法は、水溶性代謝産物のすべてのまたはほとんどのクラスを回復するために単一のタイプの代謝産物抽出を使用することはできません。第六に、既存の方法は、水溶性代謝産物の全てのクラスまたはほとんどのクラスを互いに分離するために、単一のタイプのLCカラムを使用することはできません。

ここでは 、S.セレビシエ 細胞内の代謝活性を改善し、抽出前にこれらの細胞内の水溶性代謝産物の大部分を維持し、酵母細胞からほとんどのクラスの水溶性代謝産物を抽出するための条件を最適化した。我々は 、S.セレビシエ 細胞から抽出された370以上の水溶性代謝産物のLC-MS/MSベースの同定と定量のための汎用性、堅牢で高感度な方法を開発しました。非標的化メタボロミクスのこの方法は、種々のエネルギーキャリア分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体の細胞内濃度を評価することを可能にする。開発されたLC-MS/MS法により、多様な構造、物理的、化学的特性を有する水溶性代謝産物の異なる構造異性体および立体異性体の同定と定量化が可能です。