탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics
Summary
우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.
Abstract
Metabolomics는 세포 내의 많은 저분자 중량 중간체 및 물질 대사의 제품을 식별 및 정량화하는 데 사용되는 방법론입니다. 메타볼로믹스는 전통적으로 수용성 대사산물에 초점을 맞추고 있습니다. 수용성 메타볼로메는 다양한 게놈, 전형, 전사, 프로테오믹 및 환경 요인을 통합하는 복잡한 세포 네트워크의 최종 제품입니다. 따라서, metabolomic 분석은 각종 유기체 내의 생물학 프로세스의 과다에서 이 모든 요인에 대한 행동의 결과를 직접 평가합니다. 이러한 유기체 중 하나는 완전히 서열게놈을 가진 단세포 진핵생물인 신진 효모 사카로미세스 세레비시아입니다. S. cerevisiae는 포괄적인 분자 분석에 순종하기 때문에, 진핵 세포 내의 많은 생물학적 프로세스의 근본적인 기계장치를 해부하기위한 모델로 사용됩니다. 수용성 메타볼로메의 견고하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법은 이러한 메커니즘을 해부하는 데 필수적인 방법론을 제공할 것입니다. 여기서 우리는 S. 세레비시아 세포로부터 담금질및 수용성 대사산물 추출의 최적화된 조건에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 추출된 수용성 대사산물의 정량적 분석을 위해 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 이러한 대사 산물의 다른 구조 이성질체 및 스테레오시컬 형태를 포함하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 갖춘 370개 이상의 수용성 대사산물을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이 대사 산물은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체를 포함합니다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 민감하며 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물의 식별 및 양을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 다른 조건에서 배양된 야생형 및 돌연변이 효모 세포의 수용성 메타볼로메를 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
Introduction
수용성 대사 산물은 저분자-분자량 중간체및 필수 세포 과정에 기여하는 신진 대사의 제품입니다. 이러한 진화적으로 보존된 과정에는 영양분을 사용 가능한 에너지로 변환하는 것, 거대 분자의 합성, 세포 성장 및 신호, 세포 주기 제어, 유전자 발현 조절, 스트레스 반응, 대사 후 조절, 미토콘드리아 기능 유지, 혈관 세포 인신 매매, 자가 세포 노화 및 규제 된 세포 죽음1,2,3.
수용성 대사산물의 이러한 필수 역할중 상당수는 신진 효모 S. 세레비시아1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21, 22의연구에 의해 발견되었다. 이러한 단세포 진핵생물은 수용성 대사산물이 고급 생화학, 유전적 및 분자 생물학적 분석23,24,25,26에대한 복종성으로 인한 세포 과정에 기여하는 메커니즘을 해부하는 데 유용한 모델 유기체이다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 신진 효모3,18,22,27에서수용성 대사산물의 역할을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 유형의 분석은 다재다능성, 견고성, 감도 및 이러한 대사산물의 스테레오릭 형태를 구별하는 능력의 개선이 필요합니다.
최근 몇 년 동안 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법을 생체내 용해성 대사산물 프로파일링에 적용하는 데 상당한 진전이 있습니다. 그러나, 이 방법론을 사용하는 많은 도전은2,28,29,30,31,32,33,34, 35,36남아있다. 이러한 과제에는 다음이 포함됩니다. 첫째, 많은 수용성 대사산물의 세포 내 농도는 현재 사용되는 방법에 대한 감도의 임계값 미만이다. 둘째, 대사 활성 담금질의 효율이 너무 낮고, 세포 내 대사산물의 담금질 관련 세포 누설의 정도는 현재의 방법에 대해 너무 높다; 따라서, 현재 사용되는 방법은 수용성 대사 산물의 세포 내 농도를 과소 평가한다. 셋째, 기존 방법은 구조이소(즉, 동일한 화학 적 분수하지만 다른 원자 연결을 가진 분자) 또는 스테레오이머스(즉, 동일한 화학 공식 및 원자 연결을 가진 분자,하지만 우주에서 다른 원자 배열)를 특정 대사 산물의 분화할 수 없다; 이것은 현재 사용된 방법에 의하여 특정 대사 산물의 정확한 표시를 방지합니다. 넷째, 모시 이온(MS1) 및 이차 이온(MS2)의 기존 질량 스펙트럼 온라인 데이터베이스는 불완전하다; 이는 현재 방법의 도움으로 생성된 원시 LC-MS/MS 데이터를 사용하여 특정 대사산물의 정확한 식별 및 수량에 영향을 미칩니다. 다섯째, 기존 방법은 단일 유형의 대사산물 추출을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스를 복구할 수 없습니다. 여섯째, 기존 메서드는 LC 컬럼의 단일 유형을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스와 분리할 수 없습니다.
여기에서, 우리는 S. cerevisiae 세포 내의 신진 대사 활동의 담금질을 위한 조건을, 추출하기 전에 이 세포 내의 수용성 대사산물의 대부분을 유지하고, 효모 세포에서 수용성 대사산물의 대부분의 클래스를 추출하기 위한 조건을 조정했습니다. 우리는 S. cerevisiae 세포에서 추출한 370개 이상의 수용성 대사산물의 LC-MS/MS 기반 식별 및 정량화를 위한 다재다능하고 견고하며 민감한 방법을 개발했습니다. 비표적 메타볼로믹스의 이 방법은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체의 세포내 농도를 평가할 수 있게 한다. 개발된 LC-MS/MS 방법은 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 가진 다양한 구조 이성질체 및 입체형 형태의 수용성 대사산물의 식별 및 정량화를 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 사용하려면 아래에 설명된 예방 조치를 따르십시오. 클로로폼과 메탄올은 실험실 플라스틱 제품에서 다양한 물질을 추출합니다. 따라서 신중하게 처리하십시오. 이 두 유기 용매와 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 마십시오. 이러한 단계에 는 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용합니다. 사용하기 전에 클로로폼과 메탄올로 이 파이펫을 상승시보세?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 토론에 대한 티토렌코 연구소의 현재와 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분광학의 생물학 응용 센터를 인정합니다, 구조 및 기능 유전체학센터, 및 미해결 서비스를 위한 현미경 및 세포 화상 진찰 센터 (콩코르디아 대학에 모두). 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482 CRDPJ 515900 – 17). K.M. 콩코르디아 대학 아르만드 C. 아캄볼트 펠로우십과 콩코르디아 대학 예술 과학 우수 학장의 지원을 받았습니다.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
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