מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.
Abstract
מטבולומיקה היא מתודולוגיה המשמשת לזיהוי וכימות של מתווכים ותוצרים רבים במשקל מולקולרי נמוך ומוצרים של חילוף חומרים בתוך תא, רקמה, איבר, נוזל ביולוגי או אורגניזם. מטבולומיה מתמקדת באופן מסורתי במטבוליטים מסיסים במים. המטבולום המסיס במים הוא התוצר הסופי של רשת סלולרית מורכבת המשלבת גורמים גנומיים, אפיגנומיים, שעתוקיים, פרוטאומיים וסביבתיים שונים. לפיכך, הניתוח המטבולומי מעריך ישירות את התוצאה של הפעולה עבור כל הגורמים האלה בשפע של תהליכים ביולוגיים בתוך אורגניזמים שונים. אחד האורגניזמים האלה הוא שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae, אאוקריוטה חד-תאית עם הגנום הרצף המלא. מכיוון ש- S. cerevisiae מקובל על ניתוחים מולקולריים מקיפים, הוא משמש כמודל לניתוח מנגנונים שבבית תהליכים ביולוגיים רבים בתוך התא האוקריוטי. שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה כמותית חזקה, רגישה ומדויקת של מטבולום מסיס במים תספק את המתודולוגיה החיונית לניתוח מנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התנאים הממוטבים של פעילות מטבולית מרווה פנימה ומיצוי מטבוליט מסיס במים מתאי S. cerevisiae. הפרוטוקול מתאר גם את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (LC-MS/MS) לניתוח כמותי של מטבוליטים מסיסים במים שחולצו. שיטת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת המתוארת כאן היא רב-תכליתית וחזקה. היא מאפשרת זיהוי וכימות של יותר מ-370 מטבוליטים מסיסים במים בעלי תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות, כולל איסומרים מבניים שונים וצורות סטריאואימוזוריות של מטבוליטים אלה. מטבוליטים אלה כוללים מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. שיטת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת רגישה ומאפשרת זיהוי וכמות של כמה מטבוליטים מסיסים במים בריכוזים נמוכים ככל 0.05 pmol / μL. השיטה שימשה בהצלחה להערכת מטבולומים מסיסים במים של תאי שמרים מסוג בר ומוטנטים בתרבית בתנאים שונים.
Introduction
מטבוליטים מסיסים במים הם מתווכים במשקל מולקולרי נמוך ומוצרים של חילוף החומרים התורמים לתהליכים תאיים חיוניים. תהליכים אלה השמורים אבולוציונית כוללים המרה של חומרים מזינים לאנרגיה שמישה, סינתזה של macromolecules, צמיחה תאית איתות, בקרת מחזור התא, רגולציה של ביטוי גנים, תגובת מתח, ויסות לאחר תרגום של חילוף החומרים, שמירה על פונקציונליות מיטוכונדריאלית, סחר תאי אופניים, autophagy, הזדקנות תאית, ומוות תאים מוסדר1,2,3.
רבים מהתפקידים החיוניים האלה של מטבוליטים מסיסים במים התגלו על ידי מחקרים בשמרים ניצנים S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. אאוקריוטה חד-תאית זו היא אורגניזם מודל שימושי לניתוח מנגנונים שבאמצעותם מטבוליטים מסיסים במים תורמים לתהליכים תאיים בשל נוחותו לנתחים ביולוגיים ביוכימיים, גנטיים ומולקולריים מתקדמים23,24,25,26. למרות שיטות LC-MS/ MS של מטבולומיקה לא ממוקדת שימשו לחקר התפקידים של מטבוליטים מסיסים במים בשמרים ניצנים3,18,22,27, סוג זה של ניתוח דורש שיפור הרבגוניות שלה, חוסן, רגישות, ואת היכולת להבחין בין איזומרים מבניים שונים וצורות סטריאויזומריות של מטבוליטים אלה.
השנים האחרונות מאופיינות בהתקדמות משמעותית ביישום שיטות LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת ליצירת פרופיל של מטבוליטים מסיסים במים ב- vivo. עם זאת, אתגרים רבים בשימוש במתודולוגיה זו נשארים2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. אתגרים אלה כוללים את הדברים הבאים. ראשית, הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים רבים נמצאים מתחת לסף הרגישות לשיטות הנמצאות בשימוש כיום. שנית, היעילות של מרווה פעילות מטבולית נמוכה מדי, והיקף דליפת התאים הקשורים להרוותה של מטבוליטים תאיים גבוה מדי עבור השיטות הנוכחיות; לפיכך, השיטות הנמצאות בשימוש כיום בהערכת הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים. שלישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להבדיל בין האיסומרים המבניים (כלומר, מולקולות עם אותה נוסחה כימית אך קישוריות אטומית שונה) או סטריאוטיומרים (כלומר, מולקולות עם אותה נוסחה כימית וקישוריות אטומית, אך עם הסידור האטומי השונה בחלל) של מטבוליטים ספציפיים; פעולה זו מונעת ביאור נכון של מטבוליטים מסוימים על ידי השיטות הנמצאות בשימוש כיום. רביעית, מסדי הנתונים המקוונים הספקטרליים ההמוניים הקיימים של יונים הורים (MS1) ויונים משניים (MS2) אינם שלמים; זה משפיע על הזיהוי הנכון וכמות של מטבוליטים ספציפיים באמצעות נתוני LC-MS/ MS גולמיים המיוצרים בעזרת השיטות הנוכחיות. חמישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להשתמש בסוג יחיד של מיצוי מטבוליט כדי לשחזר את כל או רוב המעמדות של מטבוליטים מסיסים במים. שישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להשתמש בסוג יחיד של עמודת LC כדי להיפרד זו מזו כולה או רוב הקטגוריות של מטבוליטים מסיסים במים.
כאן, אנו ממוטבים תנאים להרוות פעילות מטבולית בתוך תאי S. cerevisiae, שמירה על רוב מטבוליטים מסיסים במים בתוך תאים אלה לפני החילוץ, וחילוצת רוב המעמדות של מטבוליטים מסיסים במים מתאי שמרים. פיתחנו שיטה רב-תכליתית, חזקה ורגישה לזיהוי וכימות מבוססי LC-MS/MS של יותר מ-370 מטבוליטים מסיסים במים שחולצו מתאי S. cerevisiae. שיטה זו של מטבולומיה לא ממוקדת מאפשרת להעריך את הריכוזים התאיים של מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. שיטת LC-MS/MS המפותחת מאפשרת זיהוי וכימות של איסומרים מבניים שונים וצורות סטריאואימוזוריות של מטבוליטים מסיסים במים בעלי תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשתמש בהצלחה בפרוטוקול המתואר כאן, בצע את אמצעי המניעה המתוארים להלן. כלורופורם ומתנול לחלץ חומרים שונים מכלי פלסטיק במעבדה. לכן, לטפל בהם בזהירות. הימנע משימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כל אחד משני הממיסים האורגניים האלה. השתמש פיפטות זכוכית borosilicate עבור שלבים אלה. העלו את הפיפט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת טיטורנקו בהווה ובעבר על הדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה, את המרכז לגנומיקה מבנית ותפקודית, ואת המרכז למיקרוסקופיה והדמיה תאית (כולם באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים מצטיינים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482 ו- CRDPJ 515900 – 17). K.M. נתמך על ידי אוניברסיטת קונקורדיה ארמנד C. ארצ’מבולט מלגת אוניברסיטת קונקורדיה דיקן האמנויות והמדעים של מצוינות.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
References
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Génétique. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Génétique. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Génétique. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
