JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Published: January 05, 2021
doi:
10.3791/62061
, ,
1Department of Biology,Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry,Concordia University

Summary

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Abstract

Metabolomics is een methodologie die wordt gebruikt voor de identificatie en kwantificering van vele tussenproducten met een laag molecuulgewicht en producten van het metabolisme in een cel, weefsel, orgaan, biologische vloeistof of organisme. Metabolomics richt zich traditioneel op in water oplosbare metabolieten. Het in water oplosbare metaboloom is het eindproduct van een complex cellulair netwerk dat verschillende genomische, epigenomische, transcriptomische, proteomische en omgevingsfactoren integreert. Vandaar dat de metabolomische analyse direct de uitkomst van de actie voor al deze factoren beoordeelt in een overvloed aan biologische processen binnen verschillende organismen. Een van deze organismen is de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae, een eencellige eukaryoot met het volledig gesequencede genoom. Omdat S. cerevisiae vatbaar is voor uitgebreide moleculaire analyses, wordt het gebruikt als een model voor het ontleden van mechanismen die ten grondslag liggen aan veel biologische processen in de eukaryote cel. Een veelzijdige analysemethode voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van het in water oplosbare metaboloom zou de essentiële methodologie bieden voor het ontleden van deze mechanismen. Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde omstandigheden van metabole activiteit doven in en in water oplosbare metabolietextractie uit S. cerevisiae-cellen. Het protocol beschrijft ook het gebruik van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor de kwantitatieve analyse van de geëxtraheerde in water oplosbare metabolieten. De hier beschreven LC-MS/MS-methode van niet-gerichte metabolomica is veelzijdig en robuust. Het maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen, waaronder verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van deze metabolieten. Deze metabolieten omvatten verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, tussenproducten van glycolyse en tricarbonische cyclustussenproducten. De LC-MS/MS-methode van niet-gerichte metabolomica is gevoelig en maakt de identificatie en kwantificering van sommige in water oplosbare metabolieten mogelijk bij concentraties zo laag als 0,05 pmol/μL. De methode is met succes gebruikt voor het beoordelen van in water oplosbare metabolomen van wild-type en mutante gistcellen gekweekt onder verschillende omstandigheden.

Introduction

In water oplosbare metabolieten zijn tussenproducten met een laag molecuulgewicht en producten van het metabolisme die bijdragen aan essentiële cellulaire processen. Deze evolutionair geconserveerde processen omvatten de omzetting van voedingsstoffen in bruikbare energie, synthese van macromoleculen, cellulaire groei en signalering, celcycluscontrole, regulatie van genexpressie, stressrespons, posttranslataal regulatie van het metabolisme, onderhoud van mitochondriale functionaliteit, vesiculaire cellulaire handel, autofagie, cellulaire veroudering en gereguleerde celdood1,2,3.

Veel van deze essentiële rollen van in water oplosbare metabolieten zijn ontdekt door studies in de ontluikende gist S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Deze eencellige eukaryoot is een nuttig modelorganisme voor het ontleden van mechanismen waardoor in water oplosbare metabolieten bijdragen aan cellulaire processen vanwege zijn vatbaarheid voor geavanceerde biochemische, genetische en moleculair biologische analyses23,24,25,26. Hoewel de LC-MS /MS-methoden van niet-gerichte metabolomica zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van in water oplosbare metabolieten in ontluikende gist3,18,22,27, vereist dit type analyse de verbetering van zijn veelzijdigheid, robuustheid, gevoeligheid en vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van deze metabolieten.

De afgelopen jaren worden gekenmerkt door aanzienlijke vooruitgang bij het toepassen van de LC-MS/MS-methoden van niet-gerichte metabolomica op de profilering van in water oplosbare metabolieten in vivo. Veel uitdagingen bij het gebruik van deze methodologie blijven echter2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Deze uitdagingen omvatten de volgende. Ten eerste liggen de intracellulaire concentraties van veel in water oplosbare metabolieten onder een gevoeligheidsdrempel voor de momenteel gebruikte methoden. Ten tweede is de efficiëntie van het blussen van metabole activiteit te laag en is de mate van blussen-geassocieerde cellekkage van intracellulaire metabolieten te hoog voor de huidige methoden; vandaar dat de momenteel gebruikte methoden de intracellulaire concentraties van in water oplosbare metabolieten onderschatten. Ten derde kunnen de bestaande methoden geen onderscheid maken tussen de structurele isomeren (d.w.z. moleculen met dezelfde chemische formule maar verschillende atomaire connectiviteit) of stereo-isomeren (d.w.z. moleculen met dezelfde chemische formule en atomaire connectiviteit, maar met de verschillende atomaire opstelling in de ruimte) van specifieke metabolieten; dit voorkomt de juiste annotatie van bepaalde metabolieten door de momenteel gebruikte methoden. Ten vierde zijn de bestaande massaspectrale online databases van ouderionen (MS1) en secundaire ionen (MS2) onvolledig; dit beïnvloedt de juiste identificatie en kwantificering van specifieke metabolieten met behulp van de ruwe LC-MS/MS-gegevens die met behulp van de huidige methoden zijn geproduceerd. Ten vijfde kunnen de bestaande methoden geen enkel type metabolietextractie gebruiken om alle of de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten te herstellen. Ten zesde kunnen de bestaande methoden geen enkel type van de LC-kolom gebruiken om alle of de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten van elkaar te scheiden.

Hier hebben we de omstandigheden geoptimaliseerd voor het blussen van metabole activiteit in S. cerevisiae-cellen, het handhaven van de meeste in water oplosbare metabolieten in deze cellen vóór extractie en het extraheren van de meeste klassen van in water oplosbare metabolieten uit gistcellen. We ontwikkelden een veelzijdige, robuuste en gevoelige methode voor de op LC-MS/MS gebaseerde identificatie en kwantificering van meer dan 370 in water oplosbare metabolieten geëxtraheerd uit S. cerevisiae-cellen. Deze methode van niet-gerichte metabolomica maakt het mogelijk om de intracellulaire concentraties van verschillende energiedragermoleculen, nucleotiden, aminozuren, monosacchariden, glycolysetussenproducten en tricarbonylcyclustussenproducten te beoordelen. De ontwikkelde LC-MS/MS-methode maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van verschillende structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen.

Protocol

1. Het maken en steriliseren van een medium voor het kweken van gist Maak 180 ml van een compleet gistextract met bactopepton (YP) medium. Het volledige YP medium bevat 1% (w/v) gistextract en 2% (w/v) bactopepton. Verdeel 180 ml van het YP-medium gelijkmatig over vier Erlenmeyers van 250 ml. Elk van deze kolven bevat 45 ml van het YP-medium. Steriliseer de kolven met YP-medium door autoclaveren bij 15 psi/121 °C gedurende 45 minuten. 2. Wild-type giststam</p…

Representative Results

Om een kwantitatieve beoordeling van in water oplosbare metabolieten in een gistcel te verbeteren, hebben we de omstandigheden van celuitroeiing geoptimaliseerd voor metabolietdetectie. Cel doven voor dit doel omvat een snelle arrestatie van alle enzymatische reacties binnen een cel31,33,37,38. Een dergelijke stopzetting van cellulaire metabole activiteit is een…

Discussion

Om het hier beschreven protocol met succes te gebruiken, volgt u de hieronder beschreven preventieve maatregelen. Chloroform en methanol extraheren verschillende stoffen uit laboratoriumplastic. Ga er daarom voorzichtig mee om. Vermijd het gebruik van kunststoffen in stappen waarbij contact wordt gemaakt met een van deze twee organische oplosmiddelen. Gebruik borosilicaat glazen pipetten voor deze stappen. Verrijs deze pipetten voor gebruik met chloroform en methanol. Gebruik alleen micropipette tips en buizen gemaakt va…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn huidige en voormalige leden van het Titorenko-laboratorium dankbaar voor de discussies. We erkennen het Centrum voor Biologische Toepassingen van Massaspectrometrie, het Centrum voor Structurele en Functionele Genomica en het Centrum voor Microscopie en Cellulaire Beeldvorming (allemaal aan de Concordia University) voor uitstekende diensten. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN 2014-04482 en CRDPJ 515900 – 17). K.M. werd ondersteund door de Concordia University Armand C. Archambault Fellowship en de Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Materials

Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Génétique. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Génétique. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Génétique. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Quantitative MetabolomicsSaccharomyces CerevisiaeLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryQuenchingMetabolite ExtractionChloroformMethanolGlass BeadsVortexAqueous PhaseAcetonitrileLiquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image