Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

Os órgãos são compo de tipos múltiplos da pilha, cada um com funções discretas e expressando às vezes vastamente jogos diferentes dos genes. Para obter uma compreensão precisa de como um órgão funciona, muitas vezes é crítico para estudar cada tipo de célula distinta que compõe este órgão. Um dos principais métodos utilizados para explorar a possível função é a análise do transcriptoma. Este método poderoso fornece um instantâneo da expressão de gene em uma pilha, para revelar processos e caminhos ativos. Entretanto, este tipo de análise é frequentemente difícil para as populações raras da pilha que devem ser purificadas das pilhas vizinhas distante mais-abundantes. Por exemplo, a glândula acessória masculina de Drosophila é um órgão compo primeiramente de dois tipos secretora da pilha. Como o mais raro dos dois tipos da pilha compreende somente 4% das pilhas desta glândula, o uso de uma análise específica do transcriptoma do Cell-Type não tinha sido usado para ajudar a determinar a função destas pilhas.

As glândulas acessórias (AGs) são órgãos do trato reprodutivo masculino em insetos. Eles são responsáveis pela produção da maioria das proteínas do fluido seminal (proteínas do fluido seminal (SFPs) e proteínas de glândula acessória (ACPs)). Alguns desses SFPs são conhecidos por induzir as respostas fisiológicas e comportamentais em fêmeas acasaladas, comumente chamadas de resposta pós-acoplamento (PMR). Alguns dos PMRs incluem: uma taxa aumentada da ovulação e do ovo-colocação, o armazenamento e a liberação do esperma, uma mudança na dieta fêmea, e uma diminuição na receptividade fêmea aos machos cortejando secundários^1,2. Como os insetos impactam muitas questões societais importantes da saúde humana (como vetores de doenças mortais) para a agricultura (insetos podem ser pragas, ainda são críticas para a polinização e qualidade do solo), a compreensão da reprodução de insetos é uma importante área de pesquisa. O estudo de AGs e de ACPs foi avançado significativamente com o modelo do organismo Drosophila melanogaster. Estes estudos têm destacado o papel da AGS e algumas das proteínas individuais que produzem na criação do PMR, impactando o trabalho em outras espécies como o^{vetor de}doença Aedes aegypti^{3,4, e}outros insetos^{1 ,5}. Além disso, como AGS secretam os constituintes do fluido seminal^{1,6eles são} muitas vezes pensado como o análogo funcional da glândula prostática de mamíferos e vesicle seminal. Esta semelhança da função combinada com as similaridades moleculars entre os dois tecido-tipos, fêz ao AGs um modelo para a glândula de próstata nas moscas⁷.

Dentro do macho de Drosophila , há dois lóbulos de glândulas acessórias. Cada lobo pode ser visto como uma estrutura de saco-like compo de um monocamada de pilhas secretora que cercam um lúmen central, e envolvido por músculos lisos. Como mencionado acima, há dois tipos de células secretoras morfologicamente, desenvolvimentais e funcionalmente distintas que compõem esta glândula: as células principais em forma de poligonal (tornando-se ~ 96% das células), e as células secundárias maiores, redondas (SC) (tornando-se o restantes 4% das células, ou cerca de 40 células por lobo). Tem sido demonstrado que ambos os tipos de células produzem conjuntos distintos de ACPs para induzir e manter o PMR. A maioria dos dados obtidos até o momento destacam o papel de uma única proteína no desencadeamento da maioria dos comportamentos característicos da PMR. Esta proteína, o peptídeo sexual, é um pequeno, 36 aminoácido peptídeo que é secretado pelas células principais^8,9,10. Embora o peptídeo sexual pareça desempenhar um papel importante na PMR, outros ACPs, produzidos por ambas as células principal e secundária, também têm demonstrado afetar vários aspectos da PMR^{11,12,13,14 ,15,16,17}. Por exemplo, com base em nosso conhecimento atual, as SCs, por meio das proteínas que produzem, parecem ser necessárias para a perpetuação da sinalização de SP após o primeiro dia¹⁸.

Dada a raridade das SCs (apenas 80 células por macho), todo o nosso conhecimento sobre estas células e as proteínas que produzem provém de abordagens genéticas e candidatas. Até agora, somente uma lista relativamente pequena de genes foi mostrada para ser SC-specific. Esta lista inclui o proventrículo defeituoso da proteína de homeodomínio (DVE)¹⁹, o lncrna MSA²⁰, Rab6, 7, 11 e 19²¹, CG1656 e CG17575^{11, 15,21} e o fator de transcrição homeobox abdominal-b (Abd-b)¹⁸. Previamente, nós mostramos que um mutante deficiente para a expressão de Abd-B e o Lncrna MSA em pilhas secundárias (mutante deIAB-6^cocuD1 ) encurta o comprimento do PMR de ~ 10 dias a somente um dia^{12 , 18 anos} de ^{, 20}. este phenotype parece ser causado pelo armazenamento impróprio de SP no intervalo reprodutivo fêmea^12,18,20. No nível celular, as células secundárias deste mutante mostram morfologia anormal, perdendo suas estruturas características vacuol-like^18,20,21. Usando esta linha mutante, nós tentamos previamente identificar os genes envolvidos na função do SC comparando os perfis transcricional de AGS inteiros do tipo selvagem ou das glândulas acessórias do mutante¹². Além disso, outros laboratórios mostraram que o número de SC, a morfologia e o conteúdo vacuolar dependem da dieta masculina, do estado de acasalamento e da idade^21,25,26.

Embora o progresso positivo fosse feito usando estas aproximações, um transcriptoma completo do SC era longe de ser conseguido. A raridade destas pilhas neste órgão fêz difícil progredir mais mais mesmo das pilhas selvagens do tipo. Para testar a expressão gênica, as alterações nessas células após estímulos ambientais específicos seriam ainda mais difíceis. Assim, foi necessário um método para isolar e purificar o RNA SC que foi rápido e simples o suficiente para atuar diferentes origens genéticas e condições ambientais.

Ambos os genes de Abd-B e de MSA exigem um potenciador específico de 1,1 KB do complexo do bithorax de Drosophila (chamado o potenciador D1 ) para sua expressão em SCs^18,20. Esse potenciador tem sido usado anteriormente para criar um driver GAL4 que, quando associado a um UAS-GFP, é capaz de direcionar a expressão GFP forte especificamente no SCs. Assim, utilizamos esta linha como base para um protocolo FACS para isolar essas células tanto do tipo selvagem como do IAB-6^cocuD1 AGS). Como IAB-6^cocuD1 Mutant SCs exibem uma morfologia celular diferente, nós mostramos que este protocolo pode ser usado para isolar as células para a determinação de seu transcriptoma a partir deste tipo de células raras condições vastamente diferentes.