Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

Gli organi sono costituiti da più tipi di cellule, ognuna con funzioni discrete e talvolta esprimi nobili di geni molto diversi. Per ottenere una comprensione precisa di come funziona un organo, è spesso fondamentale studiare ogni tipo di cellula distinta che costituisce questo organo. Uno dei metodi principali utilizzati per esplorare la possibile funzione è l’analisi del trascrittoma. Questo potente metodo fornisce un’istantanea dell’espressione genica in una cellula, per rivelare processi e percorsi attivi. Tuttavia, questo tipo di analisi è spesso difficile per le popolazioni di cellule rare che devono essere purificate da cellule vicine molto più abbondanti. Ad esempio, la ghiandola accessoria maschile della Drosophila è un organo composto principalmente da due tipi di cellule secretorie. Poiché il più raro dei due tipi di cellule comprende solo il 4% delle cellule di questa ghiandola, l’uso di un’analisi del trascrittoma specifico di tipo cella non era stato utilizzato per aiutare a determinare la funzione di queste cellule.

Le ghiandole accessorie (AG) sono organi del tratto riproduttivo maschile negli insetti. Sono responsabili della produzione della maggior parte delle proteine del liquido seminale (proteine del liquido seminale (SFP) e proteine accessorie della ghiandola (ACP)). Alcuni di questi SFP sono noti per indurre le risposte fisiologiche e comportamentali nelle femmine accoppiate, comunemente chiamate risposta post-accoppiamento (PMR). Alcuni dei PMR includono: un aumento dell’ovulazione e del tasso di deposizione delle uova, lo stoccaggio e il rilascio di spermatozoi, un cambiamento nella dieta femminile, e una diminuzione della ricettività femminile ai maschi corteggiati secondari^1,2. Poiché gli insetti hanno un impatto su molti importanti problemi sociali dalla salute umana (come vettori per malattie mortali) all’agricoltura (gli insetti possono essere parassiti, ma sono fondamentali per l’impollinazione e la qualità del suolo), la comprensione della riproduzione degli insetti è un’importante area di ricerca. Lo studio di AG e ACP è stato avanzato in modo significativo con l’organismo modello Drosophila melanogaster. Questi studi hanno evidenziato il ruolo degli AG e di alcune delle singole proteine che producono nella creazione del PMR, influenzando il lavoro in altre specie come il vettore di malattia Aedes aegypti^3,4, e altri insetti^{1 ,5}. Inoltre, poiché gli AG secernono i costituenti del liquido seminale^1,6 sono spesso considerati come l’analogo funzionale della ghiandola prostatica dei mammiferi e della vescica seminale. Questa somiglianza di funzione combinata con somiglianze molecolari tra i due tipi di tessuto, hanno reso il GS un modello per la ghiandola prostatica nelle mosche⁷.

All’interno del maschio della Drosophila, ci sono due lobi di ghiandole accessorie. Ogni lobo può essere visto come una struttura simile a un sacco costituita da un monostrato di cellule secretorie che circondano un lumari centrale, e avvolto da muscoli lisci. Come accennato in precedenza, esistono due tipi di cellule secretorie morfologicamente, dallo sviluppo e funzionalmente distinte che compongono questa ghiandola: le cellule principali a forma di poligono (che costituiscono il 96% delle cellule) e le celle secondarie più grandi e rotonde (SC) (che costituiscono il restante il 4% delle cellule, o circa 40 cellule per lobo). È stato dimostrato che entrambi i tipi di cellule producono insiemi distinti di ACP per indurre e mantenere il PMR. La maggior parte dei dati ottenuti fino ad oggi evidenzia il ruolo di una singola proteina nell’innescare la maggior parte dei comportamenti caratteristici del PMR. Questa proteina, il peptide sessuale, è un piccolo peptide aminoacido 36 che viene secreto dalle cellule principali^8,9,10. Anche se il peptide sessuale sembra svolgere un ruolo importante nel PMR, altri ACP, prodotti da entrambe le cellule principali e secondarie, hanno anche dimostrato di influenzare vari aspetti del PMR^{11,12,13,14 ,15,16,17}. Ad esempio, sulla base delle nostre attuali conoscenze, le SC, attraverso le proteine che producono, sembrano essere necessarie per la perpetuazione della segnalazione SP dopo il primo giorno¹⁸.

Data la rarità delle SC (solo 80 cellule per maschio), tutte le nostre conoscenze su queste cellule e sulle proteine che producono provengono dalla genetica e dagli approcci candidati. Finora, solo un elenco relativamente piccolo di geni ha dimostrato di essere specifico SC. Questo elenco include la proteina dell’omeodominio Defective provenive (Dve)¹⁹, lncRNA MSA²⁰, Rab6, 7, 11 e 19²¹, CG1656 e CG17575^{11, 15,21} e il fattore di trascrizione omeobox Abdominal-B (Abd-B)¹⁸. In precedenza, abbiamo dimostrato che un mutante carente sia per l’espressione di Abd-B che per l’MSA lncRNA nelle cellule secondarie(iab-6^cocuD1 mutant) accorcia la lunghezza del PMR da 10 giorni a un solo giorno^{12 , 18} mi lato ^{, 20.}Questo fenotipo sembra essere causato dall’immagazzinamento improprio di SP nel tratto riproduttivo femminile^12,18,20. A livello cellulare, le cellule secondarie di questo mutante mostrano una morfologia anormale, perdendo le loro caratteristiche strutture vacuole^18,20,21. Utilizzando questa linea mutante, in precedenza abbiamo tentato di identificare i geni coinvolti nella funzione SC confrontando i profili trascrizionali di interi gruppi di disponibilità da ghiandole accessorie di tipo selvatico o^{mutanti 12}. Inoltre, altri laboratori hanno dimostrato che il numero SC, la morfologia e il contenuto vacuolare dipendono dalla dieta maschile, dallo stato di accoppiamento e dall’età^{di 21anni,25,26}.

Anche se sono stati compiuti progressi positivi utilizzando questi approcci, un trascrittoma SC completo era ben lungi dall’essere raggiunto. La rarità di queste cellule in questo organo ha reso difficile progredire ulteriormente anche da cellule di tipo selvatico. Per testare l’espressione genica, i cambiamenti in queste cellule dopo particolari stimoli ambientali sarebbero ancora più difficili. Pertanto, era necessario un metodo per isolare e purificare l’RNA SC che fosse abbastanza veloce e semplice da funzionare in diversi contesti genetici e condizioni ambientali.

Entrambi i geni Abd-B e MSA richiedono un potenziatore specifico di 1,1 kb dal complesso Drosophila Bithorax (chiamato potenziatore D1) per la loro espressione in SCs^18,20. Questo potenziatore è stato utilizzato in precedenza per creare un driver GAL4 che, se associato a un UAS-GFP,è in grado di guidare un’espressione GFP forte in particolare nei SCs. Così, abbiamo usato questa linea come base per un protocollo FACS per isolare queste cellule sia dal tipo selvaggio che dai ^cocuD1 aG iab-6). Poiché le SC mutate iab-6^cocuD1 mostrano una morfologia cellulare diversa, mostriamo che questo protocollo può essere utilizzato per isolare le cellule per la determinazione del loro trascrittoma da questo raro tipo di cellula in condizioni molto diverse.