Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila

Les organes sont constitués de plusieurs types de cellules, chacun e avec des fonctions discrètes et exprimant parfois des ensembles très différents de gènes. Pour obtenir une compréhension précise du fonctionnement d’un organe, il est souvent essentiel d’étudier chaque type de cellule distinct qui constitue cet organe. L’une des principales méthodes utilisées pour explorer la fonction possible est l’analyse de transcriptome. Cette méthode puissante fournit un instantané de l’expression du gène dans une cellule, pour révéler les processus actifs et les voies. Cependant, ce type d’analyse est souvent difficile pour les populations de cellules rares qui doivent être purifiées à partir de cellules voisines beaucoup plus abondantes. Par exemple, la glande accessoire mâle Drosophila est un organe composé principalement de deux types de cellules sécrétrices. Comme le plus rare des deux types de cellules ne comprend que 4% des cellules de cette glande, l’utilisation d’une analyse de transcriptome spécifique de type cellulaire n’avait pas été utilisée pour aider à déterminer la fonction de ces cellules.

Les glandes accessoires (AG) sont des organes de l’appareil reproducteur masculin chez les insectes. Ils sont responsables de la production de la plupart des protéines du liquide séminal (protéines de liquide séminal (SFP) et protéines accessoires de glande (ACPs)). Certains de ces SFP sont connus pour induire les réponses physiologiques et comportementales chez les femelles accouplées, communément appelée la réponse post-accouplement (PMR). Parmi les RPM, mentionnons : une augmentation du taux d’ovulation et de ponte, le stockage et la libération de spermatozoïdes, un changement de l’alimentation des femmes et une diminution de la réceptivité des femmes aux mâles qui courtisent secondairement^1,2. Comme les insectes ont un impact sur de nombreux problèmes sociétaux majeurs, de la santé humaine (vecteurs de maladies mortelles) à l’agriculture (les insectes peuvent être des ravageurs, mais sont essentiels à la pollinisation et à la qualité du sol), la compréhension de la reproduction des insectes est un domaine de recherche important. L’étude des AG et des ACP a été avancée de manière significative avec l’organisme modèle Drosophila melanogaster. Ces études ont mis en évidence le rôle des AG et certaines des protéines individuelles qu’ils produisent dans la création de la PMR, impactant le travail dans d’autres espèces comme le vecteur de la maladie Aedes aegypti^3,4, et d’autres insectes^{1 ,5}. En outre, comme les AG sécrètent les constituants du fluide séminal^1,6 ils sont souvent considérés comme l’analogue fonctionnel de la prostate des mammifères et la vésicule séminale. Cette similitude de fonction combinée avec des similitudes moléculaires entre les deux tissus-types, ont fait les AGs un modèle pour la prostate chez les mouches⁷.

Chez le mâle Drosophila, il y a deux lobes de glandes accessoires. Chaque lobe peut être considéré comme une structure en forme de sac composée d’une monocouche de cellules sécrétrices entourant un lumen central, et enveloppée par des muscles lisses. Comme mentionné ci-dessus, il existe deux types de cellules sécrétrices morphologiquement, développementale et fonctionnellement distinctes qui composent cette glande : les cellules principales en forme de polygonale (qui représentent environ 96 % des cellules) et les cellules secondaires plus grandes et rondes (SC) (qui composent le 4 % restants des cellules, soit environ 40 cellules par lobe). Il a été démontré que les deux types de cellules produisent des ensembles distincts d’ACP pour induire et maintenir le PMR. La plupart des données obtenues à ce jour mettent en évidence le rôle d’une seule protéine dans le déclenchement de la plupart des comportements caractéristiques de la PMR. Cette protéine, le peptide sexuel, est un petit peptide d’acide aminé de 36 qui est sécrété par les cellules principales^8,9,10. Bien que le peptide sexuel semble jouer un rôle majeur dans le PMR, d’autres ACP, produits par les cellules principales et secondaires, ont également été montrés pour affecter divers aspects de la PMR^{11,12,13,14 ,15,16,17}. Par exemple, d’après nos connaissances actuelles, les SC, par l’intermédiaire des protéines qu’ils produisent, semblent être nécessaires pour la perpétuation de la signalisation SP après le premier jour¹⁸.

Étant donné la rareté des SC (seulement 80 cellules par mâle), toutes nos connaissances sur ces cellules et les protéines qu’ils produisent proviennent de la génétique et des approches candidates. Jusqu’à présent, seule une liste relativement petite de gènes s’est avérée spécifique à SC. Cette liste comprend la protéine homéodomaine defectiveré proventriculus (Dve)¹⁹, l’ARNlM MSA²⁰, Rab6, 7, 11 et 19²¹, CG1656 et CG17575^{11, 15,21} et le facteur de transcription homéobox Abdominal-B (Abd-B)¹⁸. Précédemment, nous avons montré qu’un mutant déficient pour l’expression d’Abd-B et de l’ARNlAR MSA dans les cellules secondaires(iab-6^cocuD1 mutant) raccourcit la durée de la PMR de 10 jours à un seul jour^{12 , 18 ans, états-unis} qui ^{, 20}. Ce phénotype semble être causé par le stockage incorrect de SP dans l’appareil reproducteur féminin^12,18,20. Au niveau cellulaire, les cellules secondaires de ce mutant montrent une morphologie anormale, perdant leurs structures caractéristiques de type vacuole^18,20,21. En utilisant cette ligne mutante, nous avons précédemment essayé d’identifier les gènes impliqués dans la fonction SC en comparant les profils transcriptionnels des AG entiers de type sauvage ou de glandes accessoires mutantes¹². En outre, d’autres laboratoires ont montré que le nombre de SC, la morphologie et la teneur en vacuolateur dépendent de l’alimentation masculine, le statut d’accouplement et l’âge^21,25,26.

Bien que des progrès positifs aient été réalisés à l’aide de ces approches, un transcriptome complet de SC était loin d’être atteint. La rareté de ces cellules dans cet organe a rendu difficile de progresser plus loin, même à partir de cellules de type sauvage. Pour tester l’expression des gènes, les changements dans ces cellules après des stimuli environnementaux particuliers seraient encore plus difficiles. Ainsi, une méthode pour isoler et purifier l’ARN SC qui était assez rapide et simple pour fonctionner dans différents milieux génétiques et conditions environnementales était nécessaire.

Les gènes Abd-B et MSA nécessitent un exhausteur spécifique de 1,1 kb du complexe Bithorax Drosophila (appelé l’améliorateur D1) pour leur expression dans les SC1^,20. Cet exhausteur a déjà été utilisé pour créer un pilote GAL4 qui, lorsqu’il est associé à un UAS-GFP, est capable de conduire l’expression GFP forte spécifiquement dans les SC. Ainsi, nous avons utilisé cette ligne comme base pour un protocole FACS pour isoler ces cellules de type sauvage et iab-6^cocuD1 AGs). Comme les SC mutants iab-6^cocuD1 présentent une morphologie cellulaire différente, nous montrons que ce protocole peut être utilisé pour isoler les cellules pour la détermination de leur transcriptome de ce type de cellule rare dans des conditions très différentes.