Протокол на основе FACS для изоляции РНК из вторичных клеток Дрозофилы Мужской Аксессуар Glands

Органы состоят из нескольких типов клеток, каждый из которых имеет дискретные функции, а иногда и выражающие совершенно разные наборы генов. Чтобы получить точное понимание того, как функционирует орган, часто важно изучить каждый отдельный тип клеток, который составляет этот орган. Одним из основных методов, используемых для изучения возможной функции, является анализ транскриптома. Этот мощный метод обеспечивает снимок экспрессии гена в клетке, чтобы выявить активные процессы и пути. Однако, этот тип анализа часто трудн для редких населенностей клетки которые необходимо очистить от далеко более-обидеть соседних клеток. Например, мужская вспомогательная железа Дрозофилы является органом, состоящим в основном из двух типов секреторных клеток. Поскольку редкие из двух типов клеток составляют лишь 4% клеток этой железы, использование специфического анализа транскриптома клеточного типа не было использовано для определения функции этих клеток.

Аксессуарные железы (АГ) являются органами мужского репродуктивного тракта у насекомых. Они отвечают за производство большинства белков семенной жидкости (семенной жидкости (SFPs) и вспомогательных железных белков (ACPs)). Некоторые из этих SFPs, как известно, вызывают физиологические и поведенческие реакции у спаренных женщин, обычно называют после спаривания ответ (PMR). Некоторые из PMRs включают в себя: увеличение овуляции и яйцекладки скорость, хранение и высвобождение спермы, изменение в женской диете, и снижение женской восприимчивости к вторичной ухаживания мужчин^1,2. Поскольку насекомые влияют на многие основные социальные проблемы от здоровья человека (как переносчиков смертельных заболеваний) до сельского хозяйства (насекомые могут быть вредителями, но имеют решающее значение для опыления и качества почвы), понимание воспроизводства насекомых является важной областью исследований. Изучение AGs и ACPs было выдвинуто значительно с модельным организмом Drosophila melanogaster. Эти исследования подчеркнули роль AGs и некоторые из отдельных белков, которые они производят в создании ПМР, влияющих на работу в других видах, как болезнь вектор Aedes aegypti^3,4, и другие насекомые^{1 ,5}. Кроме того, как AGs выделяют составляющие семенной жидкости^1,6 они часто рассматриваются как функциональный аналог железы простаты млекопитающих и семенной везикулы. Эта функция сходство в сочетании с молекулярным сходством между двумя типами тканей, сделали AGs моделью для предстательной железы у мух⁷.

В Drosophila мужчины, Есть две доли аксессуаров желез. Каждая доли можно рассматривать как мешок, как структура, состоящая из монослой секреторных клеток, окружающих центральный просвет, и обернутые гладкими мышцами. Как уже упоминалось выше, Есть два морфологически, развития и функционально различных секретных типов клеток, составляющих эту железу: полигональной формы основных клеток (составляют 96% клеток), и больше, круглые вторичные клетки (SC) (составление оставшиеся 4% клеток, или около 40 клеток на одну долбу). Было показано, что оба типа клеток производят различные наборы ACPs для индуцирования и поддержания PMR. Большинство данных, полученных на сегодняшний день, подчеркивают роль одного белка в инициировании большинства характерных моделей поведения ПМР. Этот белок, половой пептид, представляет собой небольшой, 36 аминокислотный пептид, который выделяется основными клетками^8,9,10. Хотя половой пептид, кажется, играет важную роль в ПМР, другие ACPs, производимые как основными, так и вторичными клетками, также были показаны, чтобы повлиять на различные аспекты PMR^{11,12,13,14 ,15,16,17}. Например, на основе наших текущих знаний, SCs, через белки, которые они производят, как представляется, требуется для увековечения SP сигнализации после первого дня¹⁸.

Учитывая редкость SCs (только 80 клеток на мужчину), все наши знания об этих клетках и белках, которые они производят, приходят от генетики и кандидат подходов. До сих пор было доказано, что лишь относительно небольшой список генов специфичен для SC. Этот список включает в себя гомеодомен белка Дефектные proventriculus (Dve)¹⁹, lncRNA MSA²⁰, Rab6, 7, 11 и 19²¹, CG1656 и CG17575^{11, 15,21} и фактор транскрипции гомеобокса Abdominal-B (Abd-B)¹⁸. Ранее мы показали, что мутант дефицит как для выражения Абд-B и lncRNA MSA во вторичных клетках(iab-6^cocuD1 мутант) сокращает длину PMR от 10 дней до только один день^{12 , 18 лет , 20}. Этот фенотип, кажется, вызвано ненадлежащим хранением SP в женском репродуктивном тракте^12,18,20. На клеточном уровне вторичные клетки этого мутанта показывают аномальную морфологию, теряя свои характерные вакуолоподобные структуры^18,20,21. Используя эту линию мутантов, мы ранее пытались определить гены, участвующие в функции SC, сравнивая транскрипционные профили целых AGs либо из дикого типа или мутант аксессуар желез¹². Кроме того, другие лаборатории показали, что номер SC, морфология и содержание вакуолярного зависит от мужской диеты, статус спаривания и возраст^21,25,26.

Хотя с использованием этих подходов был достигнут позитивный прогресс, полный транскриптом SC был далек от достижения. Редкость этих клеток в этом органе затрудняет дальнейшее продвижение даже от клеток дикого типа. Для тестирования экспрессии генов, изменения в этих клетках после конкретных экологических стимулов будет еще труднее. Таким образом, метод изоляции и очистки SC РНК, который был достаточно быстрым и простым, чтобы работать в различных генетических фонов и условий окружающей среды было необходимо.

Оба гена Abd-B и MSA требуют специфического усилитель 1.1 кБ от комплекса Drosophila Bithorax (так называемый усилитель D1) для их выражения в SCs^18,20. Этот усилитель ранее был использован для создания драйвера GAL4, который, когда связан с UAS-GFP, способен управлять сильным выражением GFP специально в SCs. Таким образом, мы использовали эту линию в качестве основы для протокола FACS, чтобы изолировать эти клетки от дикого типа и iab-6^cocuD1 AGs). Как iab-6^cocuD1 мутант SCs дисплей различных клеточных морфологии, мы показываем, что этот протокол может быть использован для изоляции клеток для определения их транскриптома от этого редкого типа клеток в совершенно разных условиях.