Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Begin met het toevoegen van trypsine aan een petrischaal met gelabelde borstkankercellen om ze van het oppervlak los te maken. Voeg medium bevattend serum toe om de werking van trypsine te stoppen. Breng de celsuspensie over in een conische buis en centrifugeer deze naar een pelletcel.
Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Plaats de buis op ijs om het celmetabolisme te vertragen. Laad deze celsuspensie met de vereiste hoeveelheid cellen in een Luer-vergrendelingsspuit en bevestig er een naald op.
Plaats een muis in een knaagdierenbetekker met zijn staart naar buiten. Dompel de staart in warm water om de aderen te verwijden. Er zijn twee aderen aan de zijkanten en een slagader aan de ventrale kant van de staart. Veeg de staart af met alcohol, steek de naald in en injecteer de celsuspensie.
Eenmaal in de bloedbaan dringen de geïnjecteerde kankercellen binnen in organen, zoals de longen, en verspreiden zich. Verwijder langzaam de naald en gebruik een steriel gaasje op de injectieplaats om druk uit te oefenen om het bloeden te stoppen. Breng de muis terug naar zijn kooi en zorg voor een volledig herstel. In het volgende protocol demonstreren we de injectie van gelabelde gemetastaseerde kankercellen in een muismodel om borstkankermetastasen en kolonisatie te kwantificeren.
Aspireer het medium en spoel de celplaten af met 1X PBS. Probeer de cellen gedurende twee tot vijf minuten met 5 milliliter trypsine per plaat van 15 centimeter en breng alle cellen over in een conische buis. Was de resterende cellen uit de weefselkweekschaal met voldoende volledige groeimedia om de trypsine te doven. Voeg de was toe aan dezelfde conische buis. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller om het totale celnummer te bepalen.
Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende drie minuten op 122 maal G en aspireer het supernatant. Resuspend de cellen in 1X PBS in de gewenste concentratie. Hier worden 25.000 cellen in elke muis geïnjecteerd in 100 microliter PBS, dus de geresuspendeerde cellen bevinden zich op 250.000 cellen per milliliter. Houd de celsuspensingen op ijs tot injectie.
Werk in een kap in de dierenkliniek, meng de cellen voorzichtig, maar grondig door de buis om te keren of een spuit van 1 milliliter te gebruiken om ervoor te zorgen dat ze gelijkmatig worden geresuspendeerd. Laad nu een Luer-slotspuit van 1 milliliter met celsuspensie en verdrijf overtollige luchtbellen. Plaats een 1/2-inch, 30-gauge naald op de spuit met de schuine kant omhoog en verdrijf luchtbellen.
Plaats de muis voorzichtig in een knaagdierbeperk. De laterale staartader moet zichtbaar en verwijd zijn. Zo niet, knijp dan voorzichtig in de basis van de staart en dompel de staart in warm kraanwater om de aderen te verwijden. Gebruik een alcoholdoekje om de staart schoon te maken. Steek vervolgens de naald in de staartader, schuine kant naar boven en injecteer 100 microliters celsuspensie. Als de naald goed in de ader wordt gestoken, moet deze gemakkelijk iets naar voren en naar achteren glijden en mag er geen weerstand zijn wanneer de zuiger wordt geduwd.
Succesvolle injecties moeten ook resulteren in een flush, waarbij de blauwe kleur van de ader na de injectie een paar seconden wit wordt. Verwijder langzaam de naald en oefen met behulp van een steriel gaasje druk uit op de injectieplaats om bloedingen te stoppen. Breng de muis terug naar de kooi en houd deze 15 minuten in de gaten om volledig herstel te garanderen.
