Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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एक पेट्री डिश में ट्रिपसिन जोड़कर शुरू करें जिसमें लेबल किए गए स्तन कैंसर कोशिकाएं सतह से अलग हो जाती हैं। ट्राइपसिन की क्रिया को रोकने के लिए सीरम युक्त माध्यम जोड़ें। सेल सस्पेंशन को शंकु नली में स्थानांतरित करें और इसे पैलेट सेल में अपकेंद्री करें।
सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा में फिर से रखें। कोशिका मेटाबॉलिज्म को धीमा करने के लिए ट्यूब को बर्फ पर रखें। एक Luer ताला सिरिंज में कोशिकाओं की आवश्यक राशि युक्त इस सेल निलंबन लोड और उस पर एक सुई तय ।
बाहर अपनी पूंछ के साथ एक कृंतक निरोधक में एक माउस रखें। नसों को फैलाने के लिए पूंछ को गर्म पानी में डुबोएं। पार्श्व पक्षों पर दो नसें और पूंछ के वेंट्रल साइड पर एक धमनी होती है। शराब के साथ पूंछ पोंछें, सुई डालें, और सेल निलंबन इंजेक्ट करें।
एक बार खून में, इंजेक्शन कैंसर कोशिकाओं ऐसे फेफड़ों के रूप में अंगों में आक्रमण, और पैदा करना । धीरे-धीरे सुई को हटा दें और रक्तस्राव को रोकने के लिए दबाव लागू करने के लिए इंजेक्शन साइट पर बाँझ धुंध का उपयोग करें। माउस को उसके पिंजरे में लौटा दें और पूरी वसूली सुनिश्चित करें। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम स्तन कैंसर मेटास्टेसिस और उपनिवेशीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए माउस मॉडल में लेबल मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन का प्रदर्शन करते हैं।
मीडिया को एस्पिरेट करें और 1X पीबीएस के साथ सेल प्लेटों को कुल्ला करें। ट्रिपसिनाइज कोशिकाओं को दो से पांच मिनट के लिए 15 सेंटीमीटर प्लेट प्रति 5 मिलीलीटर ट्राइपसिन के साथ और सभी कोशिकाओं को शंकु नली में स्थानांतरित करें। ट्राइप्सिन को बुझाने के लिए पर्याप्त पूर्ण विकास मीडिया के साथ ऊतक संस्कृति पकवान से शेष कोशिकाओं को धोएं। एक ही शंकु नली में धोने जोड़ें। कुल सेल संख्या निर्धारित करने के लिए स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
इसके बाद, कोशिकाओं को तीन मिनट के लिए 122 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें। वांछित एकाग्रता पर 1X पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। यहां, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में प्रत्येक माउस में 25,000 कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, इसलिए पुनर्नैपित कोशिकाएं प्रति मिलीलीटर 250,000 कोशिकाओं पर होती हैं। इंजेक्शन तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
पशु सुविधा में एक हुड में काम करना, धीरे से, लेकिन अच्छी तरह से ट्यूब को उलटा करके या 1-मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके कोशिकाओं को मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे समान रूप से निलंबित हैं। अब, सेल निलंबन के साथ 1-मिलीलीटर लूयर लॉक सिरिंज लोड करें और अतिरिक्त हवा के बुलबुले को निष्कासित करें। बेवेल अप के साथ सिरिंज पर एक 1/2 इंच, 30 गेज सुई रखें और हवा के बुलबुले को निष्कासित करें ।
धीरे-धीरे माउस को कृंतक निरोधक में रखें। पार्श्व पूंछ नस दिखाई और फैली हुई होनी चाहिए। यदि नहीं, तो धीरे-धीरे पूंछ के आधार को चुटकी लें और नसों को फैलाने के लिए पूंछ को गर्म नल के पानी में डुबोएं। पूंछ को साफ करने के लिए अल्कोहल वाइप का उपयोग करें। फिर सुई को पूंछ की नस में डालें, साइड अप करें, और सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। यदि सुई को नस में ठीक से डाला जाता है, तो इसे आसानी से थोड़ा आगे और पीछे स्लाइड करना चाहिए, और प्लंजर को धक्का दिए जाने पर प्रतिरोध नहीं होना चाहिए।
सफल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप फ्लश भी होना चाहिए, जिसमें नस का नीला रंग इंजेक्शन के बाद कुछ सेकंड के लिए सफेद हो जाता है। धीरे-धीरे सुई को हटा दें, और, बाँझ धुंध का उपयोग करके, किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करें। माउस को उसके पिंजरे में लौटाएं और पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट तक निगरानी करें।