Summary

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Published: February 07, 2022
doi:

Summary

Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.

Abstract

La obtención de imágenes de especímenes biológicos con electrones para la determinación de la estructura de alta resolución mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) requiere una capa delgada de hielo vítreo que contenga las biomoléculas de interés. A pesar de los numerosos avances tecnológicos en los últimos años que han impulsado el crioEM de una sola partícula a la vanguardia de la biología estructural, los métodos por los cuales los especímenes se vitrifican para imágenes de alta resolución a menudo siguen siendo el paso limitante de velocidad. Aunque numerosos esfuerzos recientes han proporcionado medios para superar los obstáculos que se encuentran con frecuencia durante la vitrificación de muestras, incluido el desarrollo de nuevos soportes de muestra e instrumentación de vitrificación innovadora, el émbolo tradicional operado manualmente sigue siendo un elemento básico en la comunidad crioEM debido al bajo costo de compra y la facilidad de operación. Aquí, proporcionamos métodos detallados para el uso de un dispositivo estándar de blot-and-plunge operado manualmente estilo guillotina para la vitrificación de especímenes biológicos para imágenes de alta resolución mediante crioEM de una sola partícula. Además, también se describen los problemas más comunes y las recomendaciones de solución de problemas para cuando una preparación estándar no produce una muestra adecuada.

Introduction

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una poderosa técnica estructural que se puede utilizar para resolver estructuras de especímenes biológicos dinámicos a una resolución casi atómica1,2,3,4. De hecho, los recientes avances en las tecnologías de detectores directos de electrones4,5,6,7,8,9,10, las mejoras en las fuentes de electrones4,11,12,13,14 y la estabilidad de las lentes electromagnéticas15, junto con el desarrollo continuo de la adquisición de datos 16,17 y los paquetes de software de análisis18,19, han permitido a los investigadores determinar ahora rutinariamente estructuras de especímenes de buen comportamiento a una resolución de 3 Å o mejor4,11,13,14,20,21,22,23 . A pesar de estas capacidades mejoradas de procesamiento de imágenes y datos, la preparación de la red cryoEM sigue siendo el mayor impedimento para la determinación exitosa de la estructura de alta resolución y, a menudo, sirve como un cuello de botella considerable en el flujo de trabajo de EM24,25,26,27.

CryoEM se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas en soluciones acuosas que se congelan para formar una película delgada de hielo “similar al vidrio”, un proceso conocido como vitrificación, que preserva el estado bioquímico nativo. La vitrificación de muestras biológicas para crioEM se remonta a más de 40 años28,29,30 y muchas técnicas y equipos que se han desarrollado para este proceso se basan en el método de blot-and-plunge originalmente detallado31,32,33,34,35 , mediante el cual se aplica un pequeño volumen de muestra (por ejemplo, 1-5 μL) a una rejilla EM especializada antes de eliminar el exceso de solución mediante la interacción física de la rejilla con papel secante. El momento de este proceso generalmente se determina empíricamente para cada espécimen, ya que un componente crítico de las muestras de congelación es el grosor de la película de hielo vítreo: si el hielo es demasiado grueso, la calidad de la imagen se deteriora dramáticamente debido al aumento de la dispersión del haz de electrones, mientras que el hielo que es demasiado delgado puede restringir las orientaciones de las proteínas y / o excluir partículas del centro de los orificios de la lámina de la rejilla36 . Esta dependencia del espesor de hielo perfecto para la crioEM de una sola partícula ha dado lugar a una amplia gama de técnicas y equipos que pueden congelar muestras, incluida la robótica37,38, la microfluídica42 y los dispositivos ultrasónicos o de pulverización27,39,40,41,42,43,44 . En los últimos años, algunos de los dispositivos de preparación de muestras más populares se basan en el uso de la robótica para la congelación automatizada de muestras utilizando la técnica de blot-and-plunge45. Si bien estos dispositivos están diseñados para crear de manera reproducible un espesor de hielo adecuado para las imágenes, a menudo siguen siendo demasiado caros para que los laboratorios individuales los compren y operen y generalmente se encuentran dentro de las instalaciones de crioEM a precios por hora para su uso. En los últimos años, la técnica manual original de blot-and-plunge ha vuelto a ser un uso cada vez mayor3,47,48,49,50,51,52. De hecho, un dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente puede lograr rejillas crioEM de alta calidad a una fracción del costo de las contrapartes robóticas. Además, el blotting manual también ofrece a los usuarios más control sobre el blotting, ya que los investigadores pueden ajustar el tipo de blotting (es decir, el back-blotting de la cuadrícula, el front-blotting de la cuadrícula, etc.), y el tiempo de blotting en función de cada muestra individual y preguntas de investigación.

En este artículo, proporcionamos detalles sobre cómo congelar eficazmente muestras biológicas utilizando un dispositivo de vitrificación manual tradicional de borrado y inmersión junto con una plataforma dewar diseñada a medida53. Se proporcionan las mejores prácticas, incluida la preparación del criógeno, el manejo de la rejilla, la aplicación de muestras y el borrado, así como las trampas comunes y las recomendaciones sobre cómo superar estos obstáculos. Se discuten consejos sobre cómo aumentar la reproducibilidad del espesor del hielo entre las preparaciones de rejilla y cómo modificar el borrado de muestras en función del tipo de muestra biológica. Dado el bajo costo asociado con la compra y operación del émbolo manual descrito en este manuscrito, los laboratorios de todo el mundo pueden preparar especímenes biológicos para crioEM de una manera rentable y reproducible.

Protocol

1. Prepare el entorno de inmersión manual NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 5-30 minutos Ubique el émbolo manual en una cámara frigorífica de 4 °C donde se pueda ubicar un humidificador para mantener la habitación cerca del 100% de humedad relativa (HR) (Figura 1A).PRECAUCIÓN: Consulte con las pautas de Salud y Seguridad Ambiental de la institución para la ubicación segura del émbolo manual y las operaciones recomendadas. A…

Representative Results

La ejecución exitosa del protocolo de blot-and-plunge descrito aquí dará como resultado una capa delgada y uniforme de hielo vítreo que está libre de cualquier hielo hexagonal, contaminantes y grandes gradientes de hielo inutilizable que se pueden observar bajo el microscopio electrónico (Figura 3). El contacto inconsistente del papel secante con la superficie de la rejilla, la eliminación prematura del papel secante o el movimiento del papel secante durante el contacto con la rejilla…

Discussion

La vitrificación de especímenes biológicos para la obtención de imágenes mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) sigue siendo un paso de importancia crítica para la determinación exitosa de la estructura. El método manual de borrado y inmersión descrito en este protocolo representa un método rentable, confiable y robusto para congelar rápidamente muestras biológicas en películas delgadas de hielo vítreo para imágenes crioEM. Utilizando los métodos descritos en el man…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del laboratorio Herzik por pensar críticamente y proporcionar comentarios sobre este manuscrito y el contenido del video. M.A.H.Jr. cuenta con el apoyo de NIH R35 GM138206 y como Searle Scholar. H.P.M.N cuenta con el apoyo de la Beca de Capacitación en Biofísica Molecular (NIH T32 GM008326). También nos gustaría agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman y al Dr. Gabriel Lander en el Instituto de Investigación Scripps por su ayuda para diseñar, ensamblar y probar el émbolo manual que se muestra en el video.

Materials

4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22×22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090

Referencias

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
  53. Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).

Play Video

Citar este artículo
Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).

View Video