Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии

Одночастичная криогенная электронная микроскопия (криоЭМ) является мощным структурным методом, который может быть использован для решения структур динамических биологических образцов с околоатомным разрешением1,2,3,4. Действительно, последние достижения в технологиях прямых детекторов электронов4,5,6,7,8,9,10, улучшения в электронных источниках4,11,12,13,14 и стабильности электромагнитных ^линз15 в сочетании с продолжающимся развитием сбора данных ^16,17 и пакеты программного обеспечения для ^{анализа18,19} позволили исследователям в настоящее время регулярно определять структуры хорошо ведущих себя образцов с разрешением 3 Å или лучше4,11,13,14,20,21,22,23 . Несмотря на эти улучшенные возможности визуализации и обработки данных, подготовка сетки криоЭМ остается самым большим препятствием для успешного определения структуры с высоким разрешением и часто служит значительным узким местом в рабочем процессе EM24,25,26,27.

CryoEM полагается на визуализацию биологических образцов в водных растворах, которые замораживаются с образованием тонкой пленки «стеклоподобного» льда – процесс, известный как витрификация – который сохраняет исходное биохимическое состояние. Витрификация биологических образцов для криоЭМ насчитывает более 40 лет28,29,30, и многие методы и оборудование, которые были разработаны для этого процесса, основаны на первоначально детальном методе пятнистости и погружения31,32,33,34,35 , при этом небольшой объем образца (например, 1-5 мкл) наносится на специализированную ЭМ-сетку перед удалением избыточного раствора с помощью физического взаимодействия сетки с промокательной бумагой. Сроки этого процесса обычно эмпирически определяются для каждого образца, поскольку критическим компонентом замораживания образцов является толщина стекловидной ледяной пленки – если лед слишком толстый, то качество изображения резко ухудшается из-за увеличения рассеяния электронного пучка, в то время как слишком тонкий лед может ограничивать ориентацию белка и / или исключать частицы из центра отверстий фольги ^сетки36 . Эта зависимость от идеальной толщины льда для криоЭМ с одной частицей привела к широкому спектру методов и оборудования, которые могут замораживать образцы, включая ^{робототехнику37,38}, микрофлюидику42 и ультразвуковые или распылительные устройства27,39,40,41,42,43,44 . В последние годы некоторые из самых популярных устройств для подготовки образцов полагаются на использование робототехники для автоматизированной заморозки образцов с использованием метода пятнистости и ^{погружения45}. Хотя эти устройства предназначены для воспроизводимого создания надлежащей толщины льда для визуализации, они часто остаются слишком дорогими для отдельных лабораторий для покупки и эксплуатации и, как правило, находятся в криоЭМ-объектах по почасовым ставкам для использования. В последние годы оригинальная ручная техника промокания и погружения вернулась в более широкое использование3,47,48,49,50,51,52. Действительно, устройство с ручным управлением может достигать высококачественных криоЭМ-сетей за небольшую часть стоимости роботизированных аналогов. Кроме того, ручное блоттинг также предлагает пользователям больше контроля над блоттингом, поскольку исследователи могут корректировать тип блоттинга (т. Е. Обратное блоттирование сетки, переднее блоттирование сетки и т. Д.), И время блоттинга на основе каждого отдельного образца и исследовательских вопросов.

В этой статье мы подробно расскажем о том, как эффективно замораживать биологические образцы с помощью традиционного ручного устройства витрификации в сочетании с специально разработанной платформой ^dewar53. Приведены лучшие практики, включая подготовку криогена, обработку сетки, применение образцов и блоттинг, а также распространенные подводные камни и рекомендации о том, как преодолеть эти препятствия. Обсуждаются рекомендации о том, как увеличить воспроизводимость толщины льда между препаратами сетки и как модифицировать блоттинг образцов на основе типа биологического образца. Учитывая низкую стоимость, связанную с покупкой и эксплуатацией ручного плунжера, описанного в этой рукописи, лаборатории по всему миру могут подготовить биологические образцы для криоЭМ экономически эффективным и воспроизводимым способом.