単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

単粒子低温電子顕微鏡(クライオエム)は、動的生物学的標本の構造を原子に近い分解能^1,2,3,4に解決するために使用できる強力な構造技術です。実際、最近の直接電子検出器技術の進歩 4,5,6,7,8,9,10, 電子源の改善 ^{4,11,12,13,14},電磁気レンズ安定性¹⁵と相まってデータ取得の継続的な発展^16,17および分析ソフトウェアパッケージ^18,19は、研究者が3 Å解像度またはより良い3Åに行き届いた標本の構造を日常的に決定することを可能にしました^{4,11,11,13,14,20,21,22,23}.これらの改善された画像およびデータ処理機能にもかかわらず、cryoEMグリッドの準備は、高解像構造の決定を成功させるための最大の障害であり、しばしばEM^{ワークフロー24、25、26、27}においてかなりのボトルネックとなる。

CryoEMは、天然の生化学的状態を維持する「ガラス状」氷(ガラス化と呼ばれるプロセス)の薄膜を形成するために凍結された水溶液中の生物学的サンプルのイメージングに依存しています。クライオEM用の生物学的サンプルのガラス化は40年以上前まで^{さかのぼり、}このプロセスのために開発された多くの技術や機器は、当初の詳細なブロットとプランジ法に依存しています31,32,33,34,35 これは、過剰な溶液がブロッティング紙とのグリッドの物理的相互作用を使用して除去される前に、少量のサンプル(例えば、1〜5 μL)が特殊なEMグリッドに適用される。このプロセスのタイミングは、通常、氷のサンプルの重要な成分が膜膜の厚さであるように各標本について経験的に決定されます – 氷が厚すぎると、薄すぎる氷がタンパク質の配向を制限したり、グリッド箔の中心から粒子を除外することができますが、電子ビームの散乱の増加によりイメージング品質が劇的に悪化します³⁶.単粒子クライオEMのための完璧な氷の厚さにこの依存は、ロボティクス^37,38、マイクロ流体⁴²、超音波または噴霧装置^{27,39,40,41,42,43,44}を含むサンプルを凍結できる幅広い技術と機器につながっています^。.近年、最も人気のあるサンプル調製装置のいくつかは、ブロットとプランジ技術⁴⁵を使用してサンプルの自動凍結のためのロボット工学の使用に依存しています。これらのデバイスは、イメージング用の適切な氷の厚さを再現的に作成するように設計されていますが、個々のラボが購入して動作するには高価すぎることが多く、一般的にcryoEM施設内で使用のために毎時の料金で見られます。近年、オリジナルのマニュアルブロットアンドプランジ技術は、使用数が増加し^、3,47,48,49,50,51,52^{に戻ってきました}。実際、手動で操作されたブロットとプランジデバイスは、ロボットの対応するコストのほんの一部で高品質のクライオEMグリッドを実現できます。さらに、手動ブロッティングは、研究者がブロッティングの種類(すなわち、グリッドのバックブロット、グリッドのフロントブロッティングなど)、および個々のサンプルと研究の質問に基づいてブロット時間を調整できるため、より多くのユーザーがブロッティングを制御することができます。

本稿では、従来の手動ブロットとプランジガラス化装置を使用して、カスタム設計のデュワープラットフォーム⁵³と組み合わせて生物学的サンプルを効果的に凍結する方法について詳しく説明します。クライオゲンの準備、グリッド処理、サンプルアプリケーション、ブロッティングなどのベストプラクティス、これらのハードルを克服する方法に関する一般的な落とし穴と推奨事項が提供されています。グリッド調製の間の氷の厚さを向上させる方法と、生物学的標本の種類に基づいてサンプルブロッティングを変更する方法についてのアドバイスが議論されています。この原稿に記載されている手動プランジャーの購入と操作に関連する低コストを考えると、世界中のラボは、コスト効率が良く再現可能な方法でcryoEMの生物学的標本を調製することができます。