הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) היא טכניקה מבנית רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפתור מבנים של דגימות ביולוגיות דינמיות לרזולוציה כמעט אטומית1,2,3,4. ואכן, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות גלאי אלקטרונים ישיר4,5,6,7,8,9,10, שיפורים במקורות אלקטרונים4,11,12,13,14 ויציבות עדשה אלקטרומגנטית15, יחד עם המשך הפיתוח של רכישת נתונים ^16,17 וחבילות תוכנה ^{לניתוח18,19}, אפשרו לחוקרים לקבוע כעת באופן שגרתי מבנים של דגימות מחונכות היטב ל-3 רזולוציה של Å או טוב יותר4,11,13,14,20,21,22,23 . למרות יכולות הדמיה ועיבוד נתונים משופרות אלה, הכנת רשת CryoEM נותרה המכשול הגדול ביותר לקביעת מבנה מוצלח ברזולוציה גבוהה ולעתים קרובות משמשת צוואר בקבוק ניכר בזרימת העבודה EM24,25,26,27.

CryoEM מסתמכת על הדמיה של דגימות ביולוגיות בפתרונות מימיים שהוקפאו כדי ליצור סרט דק של קרח “דמוי זכוכית” – תהליך המכונה vitrification – המשמר את המצב הביוכימי המקומי. Vitrification של דגימות ביולוגיות עבור cryoEM שתחילתה מעל 40 שנים28,29,30 וטכניקות וציוד רבים שפותחו עבור תהליך זה מסתמכים על שיטת blot-and-plunge המפורטת במקור31,32,33,34,35 לפיו נפח קטן של מדגם (למשל, 1-5 μL) מוחל על רשת EM מיוחדת לפני הפתרון העודף מוסר באמצעות אינטראקציה פיזית של הרשת עם נייר סופג., התזמון של תהליך זה נקבע בדרך כלל אמפירית עבור כל דגימה כמרכיב קריטי של הקפאת דגימות הוא עובי סרט הקרח הזגג – אם הקרח סמיך מדי אז איכות ההדמיה מתדרדרת באופן דרמטי עקב פיזור מוגבר של קרן האלקטרונים בעוד קרח דק מדי יכול להגביל את אוריינטציות החלבון ו / או להוציא חלקיקים ממרכז חורי רדיד ^הרשת36 . הסתמכות זו על עובי הקרח המושלם עבור CryoEM חלקיק יחיד הובילה למגוון רחב של טכניקות וציוד שיכולים להקפיא דגימות, כולל ^{רובוטיקה37,38}, microfluidics42, והתקנים קוליים או ריסוס27,39,40,41,42,43,44 . בשנים האחרונות, חלק ממכשירי הכנת הדגימה הפופולריים ביותר מסתמכים על שימוש ברובוטיקה להקפאה אוטומטית של דגימות בטכניקת הכתם ^{והצללה45}. בעוד מכשירים אלה נועדו ליצור עובי קרח מתאים להדמיה, לעתים קרובות הם נשארים יקרים מדי עבור מעבדות בודדות לרכוש ולתפעול והם נמצאים בדרך כלל בתוך מתקני cryoEM בתעריפים לשעה לשימוש. בשנים האחרונות, טכניקת הכתם וצלילה הידנית המקורית חזרה לשימוש מוגבר3,47,48,49,50,51,52. ואכן, מכשיר כתם וצלילה המופעל באופן ידני יכול להשיג רשתות קריום באיכות גבוהה בשבריר מהעלות של עמיתים רובוטיים. יתר על כן, סופג ידני גם מציע למשתמשים יותר שליטה על סופג כמו חוקרים יכולים להתאים את סוג של blotting (כלומר, back-blotting של הרשת, החלקה קדמית של הרשת, וכו ‘), וזמן סופג בהתבסס על כל מדגם בודד ושאלות מחקר.

במאמר זה, אנו מספקים פרטים על איך להקפיא ביעילות דגימות ביולוגיות באמצעות מכשיר vitrification כתם וצלילה ידני מסורתי בשילוב עם פלטפורמת dewar מעוצבת בהתאמה ^אישית53. שיטות עבודה מומלצות, כולל הכנת קריוגן, טיפול ברשת, יישום מדגם, סופג, כמו גם מלכודות נפוצות והמלצות על איך להתגבר על משוכות אלה מסופקים. עצה כיצד להגדיל את עובי הקרח רבייה בין תכשירי רשת וכיצד לשנות כתמי מדגם בהתבסס על סוג הדגימה הביולוגית נדונים. בהתחשב בעלות הנמוכה הקשורה לרכישה ותפעול של הבוכנה הידנית המתוארת בכתב יד זה, מעבדות ברחבי העולם יכולות להכין דגימות ביולוגיות עבור cryoEM באופן חסכוני וניתן לשחזור.