Congélation manuelle par transfert et par immersion d’échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique

La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est une technique structurelle puissante qui peut être utilisée pour résoudre des structures d’échantillons biologiques dynamiques à une résolution quasi atomique1,2,3,4. En effet, les progrès récents dans les technologies de détecteurs ^{d’électrons} directs4,5,6,7,8,9,10, les améliorations des sources d’électrons4,11,12,13,14 et la stabilité des lentilles ^{électromagnétiques15}, associés au développement continu de l’acquisition de données ^16,17 et des progiciels d’analyse18,19 ont permis aux chercheurs de déterminer systématiquement les structures de spécimens bien élevés à une résolution de 3 Å ou mieux4,11,13,14,20,21,22,23 . Malgré ces capacités améliorées d’imagerie et de traitement des données, la préparation de la grille cryoEM reste le principal obstacle à la détermination réussie de la structure à haute résolution et constitue souvent un goulot d’étranglement considérable dans le flux de travail EM24,25,26,27.

CryoEM s’appuie sur l’imagerie d’échantillons biologiques dans des solutions aqueuses qui sont congelées pour former un mince film de glace « semblable à du verre » – un processus connu sous le nom de vitrification – qui préserve l’état biochimique natif. La vitrification d’échantillons biologiques pour cryoEM remonte à plus de 40 ans28,29,30 et de nombreuses techniques et équipements développés pour ce processus reposent sur la méthode de transfert et de plongeon initialement détaillée31,32,33,34,35 , par lequel un petit volume d’échantillon (p. ex., 1 à 5 μL) est appliqué sur une grille EM spécialisée avant que la solution excédentaire ne soit éliminée à l’aide de l’interaction physique de la grille avec du papier buvard. Le moment de ce processus est généralement déterminé empiriquement pour chaque échantillon, car un élément essentiel de la congélation des échantillons est l’épaisseur du film de glace vitré – si la glace est trop épaisse, la qualité de l’imagerie se détériore considérablement en raison de la diffusion accrue du faisceau d’électrons, tandis que la glace trop mince peut restreindre l’orientation des protéines et / ou exclure les particules du centre des trous de feuille de ^grille36 . Cette dépendance à l’épaisseur de glace parfaite pour le cryoEM à particule unique a conduit à un large éventail de techniques et d’équipements capables de congeler des échantillons, notamment la ^{robotique37,38}, la microfluidique42 et les appareils à ultrasons ou de pulvérisation27,39,40,41,42,43,44 . Ces dernières années, certains des dispositifs de préparation d’échantillons les plus populaires reposent sur l’utilisation de la robotique pour la congélation automatisée des échantillons à l’aide de la technique de transfert et de ^plongeon45. Bien que ces dispositifs soient conçus pour créer de manière reproductible une épaisseur de glace appropriée pour l’imagerie, ils restent souvent trop coûteux pour que les laboratoires individuels puissent les acheter et les exploiter et se trouvent généralement dans les installations cryoEM à des taux horaires d’utilisation. Au cours des dernières années, la technique originale de transfert et de plongeon manuel est revenue à une utilisation accrue3,47,48,49,50,51,52. En effet, un dispositif de transfert et de plongeon à commande manuelle peut obtenir des grilles cryoEM de haute qualité à une fraction du coût des homologues robotiques. En outre, le buvard manuel offre également aux utilisateurs un plus grand contrôle sur le buvard, car les chercheurs peuvent ajuster le type de transfert (c.-à-d. le transfert arrière de la grille, le transfert avant de la grille, etc.) et le temps de transfert en fonction de chaque échantillon individuel et des questions de recherche.

Dans cet article, nous fournissons des détails sur la façon de congeler efficacement des échantillons biologiques à l’aide d’un dispositif de vitrification manuelle traditionnelle par transfert et par immersion couplé à une plate-forme dewar conçue sur ^mesure53. Les meilleures pratiques, y compris la préparation du cryogène, la manipulation de la grille, l’application d’échantillons et le buvard, ainsi que les pièges courants et les recommandations sur la façon de surmonter ces obstacles sont fournies. Des conseils sur la façon d’augmenter la reproductibilité de l’épaisseur de la glace entre les préparations de grille et sur la façon de modifier le buvard d’échantillon en fonction du type d’échantillon biologique sont discutés. Compte tenu du faible coût associé à l’achat et à l’utilisation du piston manuel décrit dans ce manuscrit, les laboratoires du monde entier peuvent préparer des échantillons biologiques pour cryoEM de manière rentable et reproductible.