Summary

Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Published: October 18, 2018
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Summary

Mäuse sind ein unschätzbares in Vivo -Modell, Infektionen und Krankheiten, die durch Magen-Darm-Mikroorganismen zu studieren. Hier beschreiben wir die Methoden zur Untersuchung der bakteriellen Besiedelung und histopathologische Veränderungen in Mausmodellen von Helicobacter Pylori-Krankheiten.

Abstract

Helicobacter Pylori ist ein Magen-Erreger, die in der Hälfte der Weltbevölkerung vorhanden ist und ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität beim Menschen. Mehrere Maus-Modellen der Magen Helicobacter -Infektion wurden entwickelt, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, wobei die H. Pylori -Bakterien besiedeln den Magen des menschlichen Wirte und Krankheiten verursachen. Hier beschreiben wir Protokolle: 1) bereiten Sie bakterielle Aufhängungen für die in-Vivo -Infektion von Mäusen über eines-Magensonde; (2) bestimmen Sie bakterienbesiedlung in Maus Magen Gewebe, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und tragfähige zählen; und 3) krankhafte Veränderungen durch Histologie zu beurteilen. Um Helicobactäh Infektion bei Mäusen zu etablieren, bestimmten Pathogen-freies (SPF) Tiere sind zunächst mit Suspensionen (mit ≥105 koloniebildenden Einheiten KBE) der Maus besiedeln entweder Helicobacter Pylori -Stämme beimpft oder andere Magen Helicobacter spp. von Tieren, wie z. B. Helicobacter Felis. Zu den entsprechenden Zeitpunkten nach der Infektion sind Mägen ausgeschnitten und seziert sagittal in zwei gleich gewebefragmente, jeweils bestehend aus den Regionen Antrum und Körper. Eines dieser Fragmente wird verwendet für tragfähige zählen oder DNA-Extraktion, während die anderen histologischen Verarbeitung unterliegt. Bakterielle Besiedlung und histopathologische Veränderungen im Magen können routinemäßig im Magen Gewebeschnitte gebeizt mit Warthin-Starry, Giemsa oder Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken, entsprechend bewertet werden. Zusätzliche immunologische Analysen darf auch von Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz auf Maus Magen Gewebeschnitte vorgenommen werden. Die nachfolgend beschriebenen Protokolle sind speziell für die Beurteilung bei Mäusen der gastrischen Krankheiten ähnlich denen in Mensch-im Zusammenhang mit H. Pylori ermöglichen Krankheiten, einschließlich Entzündung, Atrophie der Drüse und lymphoide Follikel Bildung. Das Inokulum Vorbereitung und eines-Magensonde Protokolle können auch an die Pathogenese der anderen magensaftresistenten humanpathogene Erreger zu studieren, die Mäuse, wie Salmonella Typhimurium oder Citrobacter Rodentiumbesiedeln angepasst werden.

Introduction

Helicobacter Pylori ist eine spiralförmige, Gramnegative, menschlichen Magen Erreger vorhanden in allen Bevölkerungsgruppen auf der ganzen Welt, mit Infektionsraten in den Entwicklungsländern, die voraussichtlich in der Größenordnung von 80 %1. Obwohl die meisten H. Pylori-infizierte Personen asymptomatisch sind, einige schwere Krankheiten, Magenkrebs2von Verdauungs-Geschwüre bis zu entwickeln. H. Pylori-assoziierten Krebsarten im großen und ganzen zeichnen sich durch bösartige Veränderungen in Epithelzellen (GECs) oder durch die Bildung von extra nodal lymphatischen Gewebe im Magen, wodurch Magen Adenokarzinom oder Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom, beziehungsweise. H. Pylori ist sehr angepasst, um zu überleben in der rauen ökologische Nische des Magens durch die Anwesenheit von verschiedenen Virulenzfaktoren und Mechanismen, die Erleichterung der Einhaltung, Wachstum und Stoffwechsel in dieser Nische. Insbesondere besitzen virulente Stämme von H. Pylori 40 kb Cag Pathogenität Insel (CagPAI), die ungefähr 30 Gene für die Produktion einer Typ 4-Sekretion System (T4SS)3,4 erforderlichen kodiert . CAG PAI-positiven H. Pylori -Stämme sind verbunden mit der Induktion von höheren Ebenen der chronischen Entzündung in der Hostie, die als ein wesentlicher Vorläufer der Magen Adenokarzinom5verwickelt hat.

In Vivo Tiermodellen, insbesondere Mäuse wurden dadurch, dass Forscher untersuchen die relativen Beiträge der Host, bakterielle und umweltbedingten Faktoren auf H. Pylori -Infektion und Krankheit Ergebnis6sehr informativ. Studien haben bisher gezeigt, die verlängerte H. Pylori Infektion der Mäuse C57BL/6 genetischen Hintergrund Ergebnisse bei der Entwicklung von chronischer Gastritis und Drüse verkümmert, beide Kennzeichen von H. Pylori -Infektion-7. Infektion mit den verwandten Bakterienarten Katze/Hund, H. Felis, ist darüber hinaus nachweislich induzieren Malz Bildung bei Mäusen mit ähnlichen Pathologie und Fortschreiten der Krankheit wie im menschlichen MALT-Lymphom8,9zu sehen. Die am häufigsten verwendeten H. Pylori Isolat in Studien an Mäusen Kolonisation ist die “Sydney Sorte 1” (SS1) Belastung10, die CagPAI+ , sondern hat ein nicht-funktionale T4SS (T4SS)11. Andere weit verbreiteten Sorten sind H. Pylori B128 7.13 (CagPAI+/T4SS+)12 und X47-2AL (CagPAI/T4SS)13. Für H. Felis Infektionen, die Belastung CS1 (“Cat Spirale 1”, CagPAI/T4SS) ist in der Regel verwendete14.

Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Helicobacter Impfkulturen für in-Vivo -Infektion, das Verfahren für die eines-Magensonde von Mäusen, sowie Methoden für die Verarbeitung von Gewebe für die Untersuchung von histopathologischen Veränderungen in den Magen. Insbesondere konzentriert sich dieser Artikel auf die histologischen Methoden zur bakteriellen Besiedelung zu visualisieren und histopathologische Veränderungen, einschließlich der Malz-Bildung in der Magenschleimhaut von infizierten Mäusen zu beurteilen. Einige der hier beschriebenen Methoden kann das Studium der andere Darm-Erreger wie S. angepasst werden. Typhimurium oder C. Rodentium.

Protocol

1. Wachstum und Vorbereitung der bakteriellen Impfkulturen Tauen Sie Glycerin Bestände von H. Pylori oder H. Felis15 von-80 ° C und Subkultur auf Pferd BLUTAGAR (HBA) Platten bestehend aus: BLUTAGAR Base Nr. 2 (siehe Tabelle der Materialien); eine modifizierte “Skirrows Antibiotika selektive Ergänzung” (bestehend aus Vancomycin, 10 μg/mL; Polymyxin B, 25 ng/mL; Trimethoprim, 5 µg/mL; Amphotericin B, 2,5 μg/mL); und 5 – 10 % (V/V) Pferd Blut<sup …

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt eine orale Magensonde Technik um eines-Infektion mit H. Pylori oder H. Felis in murinen Mausmodellen (Abbildung 1) zu erreichen. Nach Euthanasie Mägen sind entfernt, gewogen und geteilt in 2 gleiche Hälften bestehend aus Antrum, Körper und nicht-Drüsen Regionen der Magen Gewebe (Abbildung 2). Nicht glanduläre Region wird entfernt, bevor Sie irgendwelche Analysen durchführen. Erfolgre…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von einem in-Vivo -Mausmodell für Helicobacter -Infektion. Die entscheidenden Schritte des Verfahrens sind die: 1) Vorbereitung der Helicobacter Inokula, lebensfähige und bewegliche Bakterien; (2) Lieferung der entsprechenden Zahl von Bakterien an die Maus über eines-Magensonde; (3) Nachweis von bakteriellen Infektionen durch koloniezahlbestimmung und/oder PCR; und 4) Verarbeitung von Magen Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Histopathologie in …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Frau A. De Paoli und Frau Georgie Wray-McCann für technische Unterstützung danken. Die Autoren erkennen Nutzung der Einrichtungen und technische Unterstützung von Monash Histologie Plattform, Institut für Anatomie und Entwicklungsbiologie, Monash University. Das Labor wird unterstützt durch Mittel aus der National Health and Medical Research Council (NHMRC) für RLF (APP1079930, APP1107930). RLF wird von einem Senior Research Fellowship von NHMRC (APP1079904) unterstützt. KD und MC sind beide von Monash Graduate Stipendien unterstützt. KD wird unterstützt vom Zentrum für angeborene Immunität und infektiöse Erkrankungen, Hudson Institute der medizinischen Forschung, während MC ein International Postgraduate Stipendium von der Fakultät für Medizin, Pflege und Gesundheitswissenschaften, Monash University hat. Forschung am Hudson Institute of Medical Research wird von der Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support-Programm unterstützt.

Materials

Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific  MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega  M8291 Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C
23g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 ml tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
 Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

Referencias

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D’Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

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