Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques
Summary
Souris représentent un modèle inestimable en vivo pour étudier les maladies infectieuses et maladies causées par des micro-organismes gastro-intestinaux. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour étudier les changements histopathologiques dans des modèles murins de Helicobacter pyloriet colonisation bactérienne-maladie liée.
Abstract
Helicobacter pylori est un pathogène gastrique qui est présent dans la moitié de la population mondiale et est une cause importante de morbidité et de mortalité chez l’homme. Plusieurs modèles de souris de l’infection à Helicobacter gastrique ont été développés pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires, par lequel les bactéries Helicobacter pylori colonisent l’estomac des hôtes humains et causer la maladie. Ici, nous décrivons les protocoles à : 1) préparer des suspensions bactériennes à l’infection en vivo de souris par gavage gastrique ; 2) déterminer les niveaux de colonisation bactérienne en tissus gastriques de souris, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et compter viable ; et 3) évaluer les changements pathologiques, en histologie. Pour établir Helicobacter infection chez la souris, animaux (SPF) exempts de micro-organismes pathogènes est d’abord inoculées avec des suspensions (contenant ≥ 105 d’unités formant des colonies, UFC) des souches colonisatrices de souris de l’ Helicobacter pylori ou autres gastrique Helicobacter spp animaux, tels que Helicobacter felis. À l’heure-points appropriés après l’infection, les estomacs sont excisés et disséqués sagittally en deux fragments de tissus égale, chacun comprenant les régions de l’antre et du corps. Un de ces fragments est ensuite utilisé pour comptage viable ou extraction de l’ADN, tandis que l’autre est soumis à traitement histologique. La colonisation bactérienne et changements histopathologiques dans l’estomac peuvent être évalués régulièrement dans des sections de tissu gastrique tachées de taches (H & E) Warthin-Starry, Giemsa ou hématoxyline et éosine, selon le cas. D’autres analyses immunologiques peuvent également être entreprises par immunohistochimie ou par immunofluorescence sur coupes de tissus gastriques de souris. Les protocoles décrits ci-dessous sont spécialement conçus pour permettre l’évaluation chez les souris des pathologies gastriques ressemblant à ceux d’anthropique Helicobacter pylori maladies, y compris l’inflammation, atrophie de la glande et la formation de follicules lymphoïdes. La préparation de l’inoculum et protocoles de gavage gastrique peuvent également être adaptées à l’étude de la pathogenèse des autres agents entéropathogènes humains qui colonisent les souris, tels que Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori est un pathogène humain, Gram négatif, en forme de spirale gastrique présent dans toutes les populations à travers le monde, avec des taux d’infection dans les pays en développement, estimées à environ 80 %1. Bien que la plupart Helicobacter pylori-personnes atteintes sont asymptomatiques, certains développent des maladies plus graves, allant de l’ulcération peptique de cancer gastrique2. Helicobacter pylori-cancers associés se caractérisent globalement par modifications malignes dans les cellules épithéliales (SCAE) ou par la formation des tissus lymphoïdes extra nodales dans l’estomac, qui en résulte dans l’Adénocarcinome gastrique ou associé aux muqueuses lymphoïde Lymphome du tissu (MALT), respectivement. H. pylori est très adapté pour survivre dans la niche écologique sévère de l’estomac en raison de la présence de divers facteurs de virulence et de mécanismes facilitant son adhésion, la croissance et le métabolisme dans ce créneau. En particulier, les souches virulentes de H. pylori possèdent le 40KO cag Pathogenicity Island (cagPAI) qui encode approximativement 30 gènes nécessaires à la production d’un Type 4 sécrétion système (T4SS)3,4 . ACG PAI-positive des souches de H. pylori sont associés à l’induction des niveaux plus élevés d’inflammation chronique chez l’hôte, qui est considéré comme un précurseur essentiel de l’Adénocarcinome gastrique5.
In vivo des modèles animaux, en particulier les souris, ont été très instructives en permettant aux chercheurs d’étudier les contributions relatives de l’hôte, des facteurs environnementaux et bactériennes sur l’infection à H. pylori et maladie issue6. Des études ont démontré précédemment que prolongé Helicobacter pylori infection de la souris sur les résultats de fond génétique C57BL/6 dans le développement d’une gastrite chronique et la glande s’atrophier, les deux maîtres mots de H. pylori infection7. Par ailleurs, l’infection avec des espèces bactériennes feline/canine, H. felis, s’est avérée induire la formation de MALT chez les souris présentant une pathologie similaire et la progression de la maladie comme on le voit l’homme MALT lymphome8,9. Le plus couramment utilisé de H. pylori isolat dans les études de colonisation de la souris est la souche « Sydney 1 » (SS1) souche10, qui est ACGPAI+ mais a un T4SS non fonctionnel (T4SS−)11. Autres souches largement utilisés sont le Helicobacter pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 et X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Pour les infections de H. felis , la souche CS1 (« Cat spirale 1 », ACGPAI–/T4SS−) est généralement utilisé14.
Ici, nous fournissons un protocole décrivant la préparation des inoculums de Helicobacter pour in vivo de l’infection, la procédure pour gavage intragastrique de souris, ainsi que des méthodes pour le traitement des tissus pour l’étude des changements histopathologiques dans l’estomac. En particulier, cet article se concentrera sur les méthodes histologiques permet de visualiser la colonisation bactérienne et d’évaluer les changements histopathologiques, incluant la formation de MALT, dans la muqueuse gastrique de souris infectées. Certaines des méthodes décrites ici peuvent être adaptées à l’étude d’autres pathogènes de l’intestin tels que S. Typhimurium ou c. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l’utilisation d’un modèle de souris in vivo pour l’infection à Helicobacter . Les étapes critiques de la procédure sont la : 1) préparation des inoculums de Helicobacter contenant des bactéries viables et mobiles ; 2) livraison du nombre approprié de bactéries à la souris par gavage gastrique ; 3) détection de l’infection bactérienne par comptage des colonies et/ou PCR ; et 4) traitement des tissus gastriques pour permettre l’évaluation de l’hist…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Mme A. De Paoli et Mme Georgie Wray-McCann pour l’assistance technique. Les auteurs reconnaissent l’utilisation des équipements et l’assistance technique de Monash histologie plate-forme, Département d’anatomie et biologie du développement, l’Université Monash. Le laboratoire est pris en charge par le financement de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à RLF (APP1079930, APP1107930). RLF est soutenu par une bourse de recherche Senior du NHMRC (APP1079904). KD et MC reposent tous deux bourses d’études supérieures de Monash. KD est également appuyé par le Centre pour l’immunité innée et Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, tandis que MC a une bourse d’études supérieures internationales de la faculté de médecine, les soins infirmiers et les Sciences de la santé, l’Université Monash. Recherche à l’Institut de recherche médicale de Hudson est pris en charge par programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Referencias
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
