Summary

헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

Published: October 18, 2018
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Summary

마우스 감염 및 위장 미생물으로 인 한 질병 연구에 귀중 한 비보에 모델을 나타냅니다. 여기, 세균성 식민과 헬리코박터 파일로리의 마우스 모델에서 histopathological 변화를 공부 하는 데 사용 하는 방법 설명-관련 질병.

Abstract

헬리코박터 파일로리 는 세계 인구의 절반에 사망률 및 인 간에 있는 사망률의 중요 한 원인이 위 병원 체 이다. 여러 마우스 모델 위 헬리코박터 감염의 분자 및 세포 메커니즘에 의하여 헬리코박터 박테리아 인간의 호스트의 위 식민지와 원인 질환 연구 개발 되었습니다. 여기, 우리는 프로토콜을 설명: 1) 세균성 정지 intragastric gavage; 통해 쥐의 비보에 감염에 대 한 준비 2) 연쇄 반응 (PCR)와 가능한 계산;에 의해 마우스 위 조직, 세균성 식민 수준을 결정합니다 그리고 3) 조직학 병리학 변화 평가. 설정 하려면 Helicobact어 쥐에 감염, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 먼저 정지 (≥105 식민지 형성 단위, CFUs를 포함 하는) 중 헬리코박터 파일로리 의 마우스 식민지 긴장의와 주사는 또는 다른 위 Helicobacter 종 동물에서와 같은 헬리코박터 felis. 적절 한 시간-포인트 후 감염에서 위장 excised 고 해 부 sagittally 2 개의 동등한 조직 파편으로 동굴 및 본문 영역을 구성 하는 각각. 다른 조직학 처리를 거쳐야 하는 동안 이러한 조각 중 하나는 가능한 계산 또는 DNA 추출에 사용 됩니다. 세균성 식민과 뱃속에 histopathological 변경 Warthin-별이 빛나는, Giemsa 또는 Haematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩으로, 적절 한으로 얼룩진 위 조직 단면도에 정기적으로 평가 될 수 있습니다. 추가 면역 분석 또한 immunohistochemistry 또는 면역 형광 마우스 위 조직 단면도에 의해 이루어져야 수 있습니다. 아래에 설명 된 프로토콜으로 인간 관련 헬리코박터 에 닮은 위 pathologies의 쥐에 있는 평가 수 있도록 설계 된 질병, 염증, 선 위축 및 림프 여 포 형성을 포함 하 여. Inoculum 준비 및 intragastric gavage 프로토콜 쥐, 살 모 넬 라 Typhimurium 등 Citrobacter rodentium식민지 다른 장의 인간 병원 체의 병 인 연구에 적응 될 수 있습니다.

Introduction

헬리코박터 파일로리 감염률 801순서 것으로 추정 하는 개발 도상국에서와 전 세계에 걸쳐 나선형 모양, 그람 음성, 인간의 위 병원 체 모든 인구에 이다. 하지만 대부분 헬리코박터-감염 된 개인은 무 증상, 일부 더 심각한 질병, 소화 궤에서 위 암2까지 개발. 헬리코박터-관련된 암은 상피 세포 (GECs)의 악성 변화에 의해 또는 형성에 의해 여분 꾸벅꾸벅 졸 기 림프 조직 위장, 위 선 암에 결과 또는 점 막 관련 림프 광범위 하 게 특징 이다 림프 조직 (맥 아), 각각. 헬리코박터 는 매우 다양 한 독성 요인 및 준수, 성장과이 틈새 시장에서 신진 대사를 촉진 하는 메커니즘의 존재로 인해 위장의 가혹한 생태 틈새에서 살아남기 위해 적응 된다. 특히 헬리코박터 의 악성 긴장 보유 40 kb cag 인코딩하는 유형 4 분 비 시스템 (T4SS)3,4의 생산에 필요한 약 30 유전자 Pathogenicity 섬 (cag파이) . cag 파이-긍정적인 헬리코박터 긴장의 위 선 암5필수적인 전조로 연루 되어 호스트에 만성 염증의 높은 수준의 유도와 관련 된.

Vivo에서 동물 모델, 특히 쥐, 되었다 매우 유익한 호스트, 헬리코박터 감염 및 질병 결과6세균성과 환경 요인의 상대적 기여를 조사 연구 함으로써. 학문은 그 연장 헬리코박터 설명 했다 이전에 개발에 만성 위 염과 동맥의 결과 유전 배경 C57BL/6 쥐의 감염 위축, 헬리코박터 감염7의 두 특징. 또한, 감염 관련된 고양이/개 세균 종, H. felis, 비슷한 병 리 및 질병 진행 인간의 맥 아 림프 종8,9에서 보듯이 쥐 몰 트 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 가장 일반적으로 사용 하는 헬리코박터 파일로리 마우스 식민지 연구에 격리 “시드니 스트레인 1″은 (SS1) 스트레인10, cag파이+ 하지만 비 기능 T4SS (T4SS)11. 다른 널리 사용 되는 긴장 포함 헬리코박터 B128 7.13 (cag파이+/T4SS+)12 과 X47 2AL (cag파이/T4SS)13. H. felis 감염, CS1 스트레인에 대 한 (“고양이 나선형 1”, cag파이/T4SS)는 일반적으로 사용 된14.

여기, vivo에서 감염에 대 한 Helicobacter inocula, 쥐의 intragastric gavage 절차 histopathological 변경의 연구에 대 한 조직의 처리 방법의 준비를 설명 하는 프로토콜 제공 에 위. 특히,이 기사 세균성 식민을 시각화 하 고 감염 된 쥐의 위 점 막에서 몰 트 형성을 포함 한 histopathological 변화를 평가 하는 데 사용 하는 조직학 방법에 초점. 여기 설명 하는 방법 중 일부 등 다른 용기 병원 균의 연구에 적용할 수 있습니다. Typhimurium 또는 C. rodentium.

Protocol

1. 성장과 세균성 Inocula의 준비 헬리코박터 파일로리 또는 H. felis15 -80 ° C와 구성 말 혈액 한 천 (HBA) 접시에 서브 컬쳐에서의 글리세롤 주식을 녹여: 혈액 한 천 자료 2 호 ( 재료의 표참조). 변경 된 “Skirrow의 항생제 선택 보충” (vancomycin, 10 μ g/mL; 구성 된 polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µ g/mL, 암포 B, 2.5 μ g/mL); 그리고 5-10% (v/v) 말 혈액15<…

Representative Results

이 프로토콜 murine 마우스 모델 (그림 1) 헬리코박터 와 H. felis intragastric 감염을 달성 하는 구강 기법을 설명 합니다. 안락사, 다음 위장은 제거, 무게와 동굴, 몸과 위 조직 (그림 2)의 선 비 영역을 구성 하는 2 동등한 반으로 나누어. 선 비 지역 어떤 분석을 수행 하기 전에 제거 됩니다. 동물의 성공적인 식민지는 일반적…

Discussion

이 프로토콜에서는 헬리코박터 감염에 대 한 vivo에서 마우스 모델의 사용을 설명합니다. 절차의 중요 한 단계는: 1) 포함 하는 실용적이 고 운동 박테리아; Helicobacter inocula의 준비 2) intragastric gavage;를 통해 마우스를 박테리아의 적절 한 숫자의 배달 3) 식민지 계산 및/또는 PCR; 세균 감염의 탐지 그리고 4) 위 조직의 활성화에 histopathology 평가 처리 위장 감염. 수정, 문제 해결 및 ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 양 A. 드 바울은 양 조지 레이-맥 캔 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 저자는 시설의 사용 및 기술 지원의 모나 쉬 조직학 플랫폼, 부의 해부학과 발달 생물학, 모나 쉬 대학 인정합니다. 실험실은 RLF (APP1079930, APP1107930)는 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 자금에 의해 지원 됩니다. RLF는 NHMRC (APP1079904)에서 수석 연구 장학금에 의해 지원 됩니다. KD와 MC 둘 다 모나 쉬 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. KD는 또한 지원 센터에 의해 타고 난 면제 및 전염 성 질병, 허드슨 연구소, 의료 연구의 MC는의 학부, 간호 및 건강 과학, 모나 쉬 대학에서 국제 대학원 장학금. 연구에는 허드슨 연구소의 의학 연구는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원 됩니다.

Materials

Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific  MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega  M8291 Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C
23g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 ml tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
 Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

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Citar este artículo
D’Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

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