Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas
Summary
Ratones representan un modelo inestimable en vivo para el estudio de la infección y las enfermedades causadas por microorganismos gastrointestinales. Aquí, describimos los métodos utilizados para estudiar la colonización bacteriana y cambios histopatológicos en modelos de ratón de Helicobacter pylori-relacionados con la enfermedad.
Abstract
Helicobacter pylori es un patógeno gástrico que está presente en la mitad de la población mundial y es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en los seres humanos. Varios modelos de ratón de la infección gástrica por Helicobacter se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares y celulares por el H. pylori bacterias colonizan el estómago de los ejércitos humanos y causan enfermedad. Adjunto, describimos protocolos: 1) preparar suspensiones bacterianas de la infección en vivo de ratones mediante sonda intragástrica; 2) determinar los niveles de colonización bacteriana en el tejido gástrico de ratón, por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y recuento de viables; y 3) evaluar los cambios patológicos, por la histología. Establecer Helicobacter infección en ratones, animales libres de patógenos específicos de (SPF) primero son inoculados con suspensiones (contiene ≥ 105 unidades formadoras de colonias, UFC) de cepas de ratón-colonización de o Helicobacter pylori o otros gástrico Helicobacter spp. de animales, tales como Helicobacter felis. En lo puntos apropiados del tiempo post-infección, estómagos son suprimidos y disecados sagittally en dos fragmentos de tejido iguales, cada uno compuesto por las regiones de antro y cuerpo. Uno de estos fragmentos entonces se utiliza para conteo de viables o la extracción de ADN, mientras que el otro se sujeta a procesamiento histológico. Colonización bacteriana y cambios histopatológicos en el estómago pueden evaluarse rutinariamente en secciones de tejido gástrico teñidas con tintes Warthin-Starry de tinción Giemsa o hematoxilina y eosina (H & E), según corresponda. Análisis inmunológicos adicionales también podrán ser efectuados por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia en secciones de tejido gástrico de ratón. Los protocolos se describen a continuación están diseñados para posibilitar la evaluación en los ratones de patologías gástricas en humanos relacionadas con H. pylori que se asemejan a las enfermedades, incluyendo inflamación, atrofia de la glándula y la formación del folículo linfoide. La preparación del inóculo y protocolos mediante sonda intragástrica también pueden ser adaptados para el estudio de la patogenia de otros patógenos entéricos humanos que colonizan ratones, tales como Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori es un patógeno gástrico en forma de espiral, Gram-negativo, humano presente en todas las poblaciones en todo el mundo, con tasas de infección en países en desarrollo que se estima en el orden de 80%1. Aunque la mayoría H. pylori-individuos infectados son asintomáticos, algunos desarrollan enfermedades más severas, entre ulceración péptica y cáncer gástrico2. H. pylori-cánceres asociados ampliamente se caracterizan por la formación de tejidos linfoides extra nodales en el estómago, dando como resultado adenocarcinoma gástrico o asociado a mucosa linfoide o cambios malignos en las células epiteliales (GECs) linfoma de tejido (Malta), respectivamente. H. pylori está altamente adaptado para sobrevivir en el nicho ecológico áspero del estómago debido a la presencia de diversos factores de virulencia y mecanismos que facilitan su adherencia, el crecimiento y el metabolismo en este nicho. En particular, las cepas virulentas de H. pylori poseen el 40 kb cag isla de patogenicidad (cagPAI) que codifica aproximadamente 30 genes necesarios para la producción de un tipo 4 secreción sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivo las cepas de H. pylori se asociado con la inducción de niveles más altos de inflamación crónica en la hostia, que se ha implicado como un precursor esencial de adenocarcinoma gástrico5.
En vivo los modelos animales, especialmente ratones, han sido altamente informativos por permitiendo a los investigadores a investigar las contribuciones relativas de host, factores bacterianos y ambientales en la infección por H. pylori y enfermedad resultado6. Los estudios han demostrado previamente que prolongada H. pylori infección de ratones en los resultados de genética de C57BL/6 en el desarrollo de gastritis crónica y de las glándulas se atrofian, ambas características distintivas del H. pylori infección7. Además, la infección con la especie bacteriana relacionada canino/felino, H. felis, se ha demostrado para inducir la formación de Malta en ratones con patología similar y progresión de la enfermedad en humanos MALT linfoma8,9. Los más comúnmente utilizados de H. pylori aislado en los estudios de colonización de ratón es la “cepa 1 de Sydney” (SS1) cepa10, cagPAI+ pero una T4SS no funcional (T4SS−)11. Otras cepas usadas incluyen H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 y X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Para las infecciones de H. felis , la cepa CS1 (“gato espiral 1, cagPAI–/T4SS−) es generalmente usado14.
Aquí proporcionamos un protocolo que describe la preparación de inóculos de Helicobacter infección en vivo , el procedimiento para sonda intragástrica de ratones, así como métodos para el procesamiento de tejidos para el estudio de los cambios histopatológicos en el estómago. En particular, este artículo se centrará en los métodos histológicos utilizados para visualizar la colonización bacteriana y evaluar cambios histopatológicos, incluyendo formación de Malta, en la mucosa gástrica de ratones infectados. Algunos de los métodos aquí descritos se pueden adaptadas al estudio de otros patógenos intestinales como S. Typhimurium o C. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el uso de un modelo de ratón en vivo para la infección por Helicobacter . Los pasos críticos del procedimiento son el: 1) preparación de los inóculos de Helicobacter que contiene bacterias viables y móviles; 2) la entrega de los números apropiados de bacterias para el ratón mediante sonda intragástrica; 3) detección de infección bacteriana por recuento de colonias o PCR; y 4) procesamiento de los tejidos gástricos para permitir la evaluación de la histopatol…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Sra. A. De Paoli y la Sra. Georgie Wray-McCann para asistencia técnica. Los autores reconocen el uso de las instalaciones y asistencia técnica de Monash plataforma de histología, Departamento de anatomía y Biología del desarrollo, Universidad de Monash. El laboratorio es apoyado por el financiamiento de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a RLF (APP1079930, APP1107930). RLF es apoyado por una beca de investigación Senior de la NHMRC (APP1079904). KD y MC son apoyados por becas de postgrado de Monash. KD también es apoyado por el centro para la inmunidad innata y la infecciosa enfermedades, del Instituto Hudson de investigación médica, mientras que MC tiene una beca de Postgrado Internacional de la Facultad de medicina, enfermería y Ciencias de la salud, Universidad de Monash. Investigación en el Instituto de investigación médica de Hudson es apoyado por el programa de apoyo a infraestructura operacional del gobierno victoriano.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Referencias
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