Fare modelleri Helicobacter enfeksiyonu ve gastrik patolojiler
Summary
Fareler enfeksiyon ve gastrointestinal mikroorganizmalar tarafından neden olduğu hastalıklar çalışmaya bir çok değerli vivo içinde modeli temsil. Burada, bakteriyel kolonizasyon ve Helicobacter pylorifare modelleri histopatolojik değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntemleri tarif-hastalığı ile ilgili.
Abstract
Helicobacter pylori dünya nüfusunun yarısı var ve önemli bir morbidite ve mortalite insanlarda nedenidir bir mide patojeni var. Birkaç fare modelleri gastrik Helicobacter enfeksiyonunun sayede H. pylori bakteri mide insan ana kolonize ve hastalığa neden moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. Burada, biz protokollere tarif: 1) intragastric sonda ile besleme; yoluyla farelerin vivo içinde enfeksiyon Bakteriyel süspansiyonlar hazırlamak 2) polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve uygun hesap tarafından fare gastrik dokularda bakteriyel kolonizasyon düzeylerini belirlemek; ve 3) patolojik değişiklikler, Histoloji tarafından değerlendirmek. Kurmak Helicobacter farelerde enfeksiyon için belirli patojen-Alerjik (SPF) hayvanlar ilk fare kolonileşmesi suşları ya Helicobacter pylori , süspansiyonlar (≥105 koloni oluşturan birimler, CFUs içeren) ile aşılanmış veya hayvanlardan, diğer mide Helicobacter spp. gibi Helicobacter felis. Uygun zaman-puan sonrası enfeksiyon mideleri varlığına ve sagittally iki eşit doku parçaları, her test ve vücut bölgelerinde oluşan disseke. Diğer histolojik işleme tabi tutulur iken bu parçaları birini daha sonra uygun sayma ya da DNA ekstraksiyon, için kullanılır. Bakteriyel kolonizasyon ve midede histopatolojik değişiklikleri düzenli olarak Warthin yıldızlı, Giemsa veya Haematoxylin ve eozin (H & E) lekeleri, uygun ile lekeli gastrik doku bölümlerde değerlendirildi. Ek immünolojik değerlendirmeler de immünhistokimya veya fare gastrik doku bölümlerinde ayirt tarafından üstlenilen. Aşağıda açıklanan protokoller gastrik patolojiler bu insan ile ilgili H. pylori benzeyen farelerde değerlendirilmesi etkinleştirmek için özel olarak tasarlanmış hastalıklar, iltihap, bezi atrofi ve lenfoid folikül oluşumu gibi. İnoculum hazırlanması ve intragastric sonda ile besleme iletişim kuralları da fare, Salmonella Typhimurium veya Sitrobacter rodentiumgibi kolonize diğer enterik insan patojenleri patogenezinde çalışmaya adapte olabilir.
Introduction
Helicobacter pylori enfeksiyonu oranları gelişmekte olan ülkelerde % 801sırasına göre olduğu tahmin ile dünya çapında spiral şeklinde, gram-negatif, insan mide patojen mevcut tüm nüfus var. Her ne kadar çoğu H. pylori-enfekte bireylerin asemptomatik, biraz daha ağır hastalıkları, peptik ülser mide kanseri2‘ ye kadar geliştirmek. H. pylori-ilişkili kanserler geniş oluşumu ekstra nodal lenfoid doku mide, mide adenokarsinom sonuçlanan veya mukoza ilişkili lenfoid veya malign degisimler epitel hücreleri (GECs) tarafından karakterize doku (MALT) Lenfoma, anılan sıraya göre. H. pylori mide çeşitli virülans faktörleri ve mekanizmaları, bağlılık, büyüme ve metabolizma bu niş içinde kolaylaştırmak varlığı nedeniyle sert ekolojik niş içinde hayatta kalmak için son derece uyarlanmıştır. Özellikle, öldürücü soy-in H. pylori 40 kb cag patojenitesi Adası (cagPAI) yaklaşık 30 genler bir tip 4 salgı sistemi (T4SS)3,4 üretimi için gerekli kodlar sahip . cag PAI-pozitif H. pylori suşları karıştığı gastrik adenokarsinom5temel bir habercisi konak, kronik inflamasyon yüksek düzeyde indüksiyon ile ilişkilidir.
İn vivo hayvan modelleri, özellikle fareler, araştırmacılar host, H. pylori enfeksiyonu ve hastalık sonucu6bakteriyel ve çevresel faktörlere göreli katkılarıyla araştırmak için izin vererek son derece bilgilendirici olmuştur. Çalışmalar daha önce gösterdi bu uzun H. pylori enfeksiyonu C57BL/6 genetik arka plan sonuçlarını geliştirme kronik gastrit ve bezi farelerin atrofi, H. pylori enfeksiyonu7her iki işaretlerinden. Ayrıca, enfeksiyon ile ilgili kedi/köpek bakteriyel türler, H. felis, MALT oluşumu benzer patoloji ve insan MALT lenfoma8,9‘ da görüldüğü gibi hastalık ilerlemesi ile farelerde ikna etmek için gösterilmiştir. En sık kullanılan H. pylori izole fare kolonizasyon çalışmaları olduğunu “Sydney zorlanma 1” hangi cagPAI+ ama işlevsel olmayan bir T4SS vardır (SS1) zorlanma10, (T4SS−)11. H. pylori yaygın olarak kullanılan diğer suşları dahil B128 7,13 (cagPAI+/T4SS+) (cagPAI–/T4SS−)1312 ve X47-2AL. H. felis enfeksiyonları, zorlanma CS1 için (“kedi sarmal 1”, cagPAI–/T4SS−) olduğunu genellikle kullanılan14.
Burada, Helicobacter inocula vivo içinde enfeksiyon için yordamı farelerin intragastric sonda ile besleme için hem de histopatolojik değişikliklerin incelenmesi için dokuların işleme yöntemleri hazırlanması açıklayan bir protokol sağlar mide. Özellikle, bu makalede bakteriyel kolonizasyon görselleştirmek ve MALT oluşumu, virüslü fareleri gastrik mukoza dahil histopatolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan histolojik yöntemleri ele alınacak. Burada açıklanan yöntemlerden bazıları diğer gut patojenleri S. gibi çalışmanın adapte olabilir Typhimurium veya C. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı bir vivo içinde fare modeli Helicobacter enfeksiyon için açıklar. Yordam kritik adımlar şunlardır: 1) canlı ve hareketli bakteri; içeren Helicobacter inocula hazırlanması 2) için fareyi intragastric sonda ile besleme yoluyla bakteri uygun sayıda teslim; 3) koloni sayımı ve/veya PCR bakteriyel enfeksiyon tespiti; ve 4) işleme histopatoloji içinde değerlendirilmesi etkinleştirmek için mide dokuların enfekte mideleri. Değişiklikler, sorun giderme ve tekn…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Bayan A. De Paoli ve Bayan Georgie Wray-McCann teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar tesislerinin kullanımı ve Monash Histoloji Platform, anatomi bölümü ve gelişim biyolojisi, Monash Üniversitesi Teknik yardım kabul edersiniz. Laboratuvar Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) RLF (APP1079930, APP1107930) için fon tarafından desteklenir. RLF NHMRC (APP1079904) bir üst düzey araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. KD ve MC her ikisi de Monash Lisansüstü Bursları tarafından desteklenir. MC bir uluslararası yüksek lisans burs Tıp Fakültesi, Hemşirelik ve Sağlık Bilimleri, Monash Üniversitesi varken KD doğuştan gelen bağışıklık ve enfeksiyöz hastalıklar, Hudson Enstitüsü tıbbi araştırma, aynı zamanda merkezi tarafından desteklenir. Araştırma, Hudson Enstitüsü tıbbi araştırma Victoria Hükümeti’nın operasyonel altyapı desteği programı tarafından desteklenir.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Referencias
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
