Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid damlacıkları oldukça nötr lipidlerin bir çekirdekten oluşan dinamik sitoplazmik (ve nükleer) hücre organelleri (trigliserit (TG) ve kolesterol ester (CE)) gömülü protein ¹ ile birlikte fosfolipitlerin bir tek tabaka ile kaplanır. Tüm hücre tipleri lipid damlacıkları üretmek, ancak, ebat, lipid bileşimi ve protein dekorasyon değişir. Lipid damlacıkları enerji ve membran ön-madde rezervuar ya da protein birikintilerinin olarak hizmet dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonları yerine getirirler. Buna ek olarak, lipid alımı ile, bu sinyal molekülleri lipotoksisite hücreleri, salma lipidler korumak ve protein bozulması ve endoplazmik retikulum (ER), stres tepkileri ² katılmaktadırlar. Bu şekilde, bir protein konakçı lipid damlacıkları bağlanan ve diğer organellere ile üretimi, bozulma, ticareti ve etkileşimi idare. Bunlar arasında (PLIN1-5) iyi niyetli lipit damlacığı bağlayıcı proteinlerin perilipin ailesidirf "> 3.

Lipit damlacık biogenesis muhtemelen nötr lipidlerin bir lens, son maya ⁴ güzel görselleştirilmiştir bir oluşturma yöntemi, ER-yerleşik enzimler membran çift katman içinde birikir nötral lipidlerin sentezini katalize eden ER, başlar. Bükme Membran ve yüksek fosfatidik asit ve diasilgliserol seviyeleri daha sonra lipit damlacık oluşturma ⁵ için gerekli olan temel nötral lipitler ve koruyucu fosfolipidlerin eşzamanlı sentezi, fosfolipid biyosentezinde yer alan proteinleri çekmek için düşünülmektedir. ER ikamet transmembran etki barındıran enzimler bu işlemi katalize eder. büyük lipid damlacıkları Genişleme bir amfipatik heliks liman ve böylece lipid damlacıkları ER'den hareket edebilir lipid sentezleyen enzimlerin farklı sınıfının aktivitesini gerektirir. lipid damlacıkları lipidlerin harekete trigliserit lokal aktivasyonu yoluyla meydana gelirE ve diasilgliserol lipazlar yağ trigliserit lipaz (ATGL) hormona duyarlı lipaz (HSL) veya makro ve microlipophagy veya farklı otofajik yollar ile otofajiyi ⁶ dolayımlı şaperon. Lipid damlacıkları ve ER (beta-oksidasyon ve lipid sentezi için) olarak mitokondri gibi diğer hücresel organeller, etkileşime girmez, fakat (lipid sentezi ve protein göçünü gibi) da lizozomun endozomlarda, ve hücre içi bakteri ⁷ ile uyarılan vakuollü. Gerçekten de bakteri, virüs ve hatta parazitler, bunların HCV ⁸ arasında replikasyon ve kalıcılığı için lipid damlacıkları hedefler.

HCV enfeksiyonu yılı ⁹ başına yaklaşık 0,5 milyon ölüme muhasebe dünya çapında karaciğer ile ilişkili morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. HCV enfeksiyonlarının gerçek sayı bilinmiyor, ancak son tahminler 130 düşündürmektedir – 150 milyon insan kronik olarak enfekte olmaktadır. hiçbir vaccinE var, ancak son zamanlarda onaylanmış direkt etkili antiviraller büyük ölçüde standart interferon-bazlı terapi ile karşılaştırıldığında tedavi edici müdahalelerin artırılması. Ancak, dünya çapında hastaların tedavi olasılığı nedeniyle yeni tedavilerin son derece yüksek maliyetlere sınırlandırılacaktır. Tüm bireylerde yaklaşık yarısı kronik karaciğer yağlanması hastalığı (steatoz), hepatositlerde lipid damlaları aşırı birikimi ile karakterize edilen bir durum geliştirme HCV ile enfekte edilmiştir. İlgi çekici bir lipid damlacıkları farazi viral montaj alanlarında ^{10, 11} olarak işlev gören, HCV replikasyonu için hayati hücresel organellere ortaya çıktı.

HCV ile enfekte olmuş hücrelerde viral protein çekirdek ve NS5A diasilgliserol asiltransferaz-1 (DGAT1) inhibitörleri olarak, trigliserid biyosentezi üzerinde bağlı olan bir süreç içinde lipid damlacıkları lokalize lipid damlacıkları ve daha sonra, HCV partikül üretimi ¹² kaçakçılığı zarar </sup^{>, 13, 14, 15.} Buna ek olarak, iç kısmın veya NS5A ya lipit damla bağlayıcı bölgeleri mutasyonlar HCV düzeneğinin ^{16, 17} bastırır. Çekirdek ve NS5A sonra yakından ¹⁶ damlacıklar lipit bağlantılı zarlara, diğer viral proteinler, ve aynı zamanda viral RNA replikasyon komplekslerinin işe. Tüm viral proteinlerin bir uyumlu eylem enfeksiyöz viral döl ^{10, 11} başarılı üretimi için gereklidir. yapısal proteinler viryonların parçasıdır ve yapısal olmayan proteinleri, bu işlem için gerekli protein-protein etkileşimlerini kolaylaştırmak. İlgi çekici hakiki lipit damla bağlayıcı protein PLIN3 / TIP47 hem HCV RNA replikasyonu ve virionlar ¹⁸ serbest ^{bırakılması, 19} için gerekli olan <sup> ^20. Bu son gelişmelere rağmen, özellikle HCV replikasyonu geç evrelerinde virüs konak etkileşimlerin mekanik detayları, düzensiz sınırlı kalır ve lipit damlacıklarının kesin işlevi bilinmemektedir.

Burada, ilişkili proteinlerin kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, lipid damlalarıyla-böler co ve etkili HCV olgunlaşması ²¹ için gerekli olan bir konakçı proteini olarak, HCV enfeksiyonu sırasında lipit damla proteomu derin değişiklikler ve tanımlanan anneksin A3 bulundu.