Summary

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Published: April 17, 2017
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Summary

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

Abstract

지질 방울은 비리의 형태 형성의 추정되는 사이트로, 다른 병원균의 다양한 가장 눈에 띄게 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 복제에 중요합니다. 양적 지질 방울 프로테옴 분석에 지역화 또는 바이러스 감염과 같은 조건에서 지질 방울에서 변위 단백질을 식별 할 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 HCV 감염 다음과 같은 지질 방울 프로테옴의 변화를 특징 짓는 데 사용 된 프로토콜을 설명합니다. 우리는 세포 배양 (SILAC)에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨 사용하여 질량 분석에 의해 단백질을 정량하는 "무거운"아미노산 셀 중 하나 명 인구의 전체 프로테옴 레이블을 붙입니다. 도 1 및 저장성 완충액에 용해 기계적 : 지질 방울 분리를위한 두 개의 세포 집단 (즉, HCV 감염 / "광"아미노산 및 비감염 제어 / "무거운"아미노산 1) 혼합한다. 핵 및 세포 D를 제거한 후저속 원심 분리에 의해 ebris은 지질 방울 – 관련 단백질은 등장 완충액 세 세척 단계 다음에 두 단계 이후의 초 원심 분리에 의해 농축된다. 지질 방울 분획의 순도는 상이한 세포 내 구획을 인식하는 항체로 웨스턴 블 롯팅하여 분석한다. 지질 방울 – 관련 단백질 후 쿠마시 염색 하였다 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리된다. 트립신 소화 후에, 펩티드는 액체 크로마토 그래피 – 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS / MS)에 의해 정량화된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 프로 또는 바이러스 호스트 요소를 나타낼 수 HCV 감염시 지질 방울에 모집 단백질을 확인했다. 우리의 방법은 병원체 감염, 환경 스트레스, 약물 치료와 같은 다른 세포 및 배양 조건의 종류에 적용될 수있다.

Introduction

지질 방울 높은 중성 지질 코어 이루어지는 동적 세포질 (핵) 세포 소기관이다 (중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)) 임베디드 단백질 1 인지질 단층에 의해 둘러싸인. 모든 종류의 세포는 지질 방울을 생산하지만, 크기, 지질 성분, 단백질 장식 다양합니다. 지질 소적 에너지와 막 전구체 저수지 또는 단백질 침착 물로서 작용 등 다양한 기능을 수행. 또한, 지질의 흡수를 통해, 그들은 신호 분자로서 세포에서 리포 독성 (lipotoxicity), 박리 보호 지질 및 단백질 분해하고 소포체 (ER) 스트레스 반응에 관여하는 2. 따라서, 단백질의 호스트 지질 방울에 결합하여 다른 세포 소기관과 함께 자신의 생성, 파괴, 인신 매매, 및 상호 작용을 제어합니다. 그 중 (PLIN1-5) 선의의 지질 방울 결합 단백질의 perilipin 가족F "> 3.

지질 생합성 액적 가능성 중성 지질 렌즈 최근 효모 4 좋게 가시화하는 처리를 형성 ER 상주 효소 막 이중층 내에 축적 중성 지질 합성을 촉매 소포체에서 시작한다. 굽힘 막과 높은 포스 폰산 및 디아 실 글리세롤의 수준은 다음 지질 액적 생성 (5)에 필요한 코어 중성 지질 및 인지질 차폐 동시로 합성 인지질 생합성에 관여하는 단백질을 유도하는 것으로 생각된다. 응급실에있는 횡단 도메인을 품고 효소는이 과정을 촉진. 큰 지질 방울에 확장은 양친 매성 나선 항구 따라서 지질 방울에 ER에서 여행 할 수 지질 합성 효소의 다른 클래스의 활동을 필요로한다. 지질 방울로부터 지질의 동원은 triglycerid의 지역의 활성화를 통해 발생E 및 디아 실 글리세롤 리파제는 트리글리세리드 지방 분해 효소 (ATGL) 및 호르몬 민감성 리파아제 (HSL) 또는 다량 및 microlipophagy autophagic 또는 상이한 경로에 의해 자식 작용은 6 매개 샤페론. 지질 방울 및 ER (베타 – 산화 및 지질 합성) 같은 미토콘드리아와 같은 다른 세포 소기관과 상호 작용하지만, (지질 합성과 단백질 밀수)도 리 소솜, 엔도 솜 및 세포 내 박테리아 (7)에 의해 유도 된 액포로. 실제로 박테리아, 바이러스, 심지어 기생충은 그들 HCV (8) 사이에 복제 및 지속성에 대한 지질 방울을 대상.

HCV 감염은 9 학년 당 약 50 만 명이 사망를 차지, 전 세계적으로 간 관련 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. HCV 감염의 진정한 수를 알 수 있지만, 최근의 추정치는 130 것을 제안 – 150,000,000명이 만성적으로 감염된다. 어떤 VACCIN 없습니다전자는 존재하지만, 최근에 승인 된 직동 항 바이러스 극적으로 표준 인터페론 기반 치료에 비해 치료 반응을 증가시킨다. 그러나 전 세계적으로 환자의 치료는 가능성으로 인해 새로운 치료제의 매우 높은 비용으로 제한됩니다. 모든 개인의 약 절반이 만성 지방간 질환 (지방간), 간세포의 지질 방울의 과도한 축적을 특징으로하는 조건을 개발 HCV에 감염. 흥미롭게도, 지질 방울도 추정되는 바이러스 성 조립 사이트 (10), (11)의 역할, HCV 복제 같은 중요한 세포 소기관을 나타났다.

HCV에 감염된 세포에서, 바이러스 단백질 코어 및 NS5A는 디아 실 글리세롤 아실 트랜스퍼 라제 1 (DGAT1)의 억제제로서, 중성 생합성에 따라 공정에서 지질 소적에 지역화 지질 방울과 후속 HCV 입자 제조 12 피킹 악영향 </sup> 13, 14, 15. 또한, 코어 또는 NS5A 중의 지질 방울 – 결합 도메인의 돌연변이 HCV 조립체 (16), (17)을 억제. 코어 및 NS5A는 밀접하게 16 방울 지질과 관련된 세포막에, 다른 모든 바이러스 성 단백질뿐만 아니라 바이러스 성 RNA 복제 단지를 모집. 모든 바이러스 단백질의 공동 작업은 전염성 바이러스 자손 (10), (11)의 성공적인 생산을 위해 필요합니다. 구조적 단백질은 비리 온의 일부분이며, 비 구조 단백질은이 과정에 필요한 단백질 – 단백질 상호 작용을 촉진한다. 흥미롭게도, 선의의 지질 방울 – 결합 단백질 PLIN3 / TIP47 모두의 HCV RNA 복제 및 비리 온 (18)의 릴리즈 19에 필요 <sup> 20. 이러한 최근의 발전에도 불구하고, 특히 HCV 복제의 후기 단계 동안 바이러스 – 호스트 상호 작용의 기계적인 세부 사항은, 잘못 정의 된 남아 있고, 지질 방울의 정확한 기능은 알 수 없습니다.

여기서는 연관된 단백질의 정량적 질량 분석을위한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 지질 방울-fractionates 공동 효율적인 HCV 성숙 (21)에 요구되는 호스트 단백질로서 HCV 감염 동안 지질 방울 프로테옴의 큰 변화 및 식별 넥신 A3 알았다.

Protocol

세포 배양에서 아미노산으로 안정 동위 원소 표지 (SILAC) 용 매체 1의 제조 주 : 여기에서, SILAC 단백질 정량 키트 – DMEM이 SILAC 표지에 사용 된 13 C 6 아르기닌 L 염산 50 mg의 보충. 투석 된 소 태아 혈청 (FCS)을 SILAC 단백질 정량 키트가 제공된다. DMEM 배지에서 각각 50 ㎖ 병을 제거하고 투석 된 FCS 50 mL를 첨가. 13 C 6 L 라이신 2HCl 50 mg?…

Representative Results

지질 방울 비리 어셈블리의 추정 ​​사이트와 같은 HCV 감염에 매우 중요하지만, 형태 형성과 비리의 출구의 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 이 과정에 관여하는 신규 한 호스트 종속 요소를 식별하기 위해 HCV에 감염된 세포를 21 (도 1a)의 양적 지질 방울 프로테옴 분석을 수행 하였다. 우리는 지질 소적의 정제를위한 프로토콜을 확…

Discussion

여기서, 우리는 바이러스 감염 등 다양한 배양 조건에서 지질 소적과 연관된 단백질의 농축 및 고갈 비교 정량 지질 방울 프로테옴 분석 지질 방울을 분리하는 프로토콜을 기술한다. 다른 방법으로, 프로테옴 분석 전체 피크 강도에 기초하여 라벨없는 정량화하여 수행 될 수있다. 이 메소드는 동적 범위 제한이 없으며 대사 문제를 피할 수있다. SILAC 접근법의 장점은 샘플 전에 지질 방울 분리를 ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리의 JFH1 구성, T. 와키 타 (국립 연구소의 JC1 구조에 대한 R. 문헌 [Bartenschlager (하이델베르크 대학)의 Huh7.5 세포에 대한 CM 라이스 (록펠러 대학교), J 맥로치랜 (의학 연구위원회 (Medical Research Council) 바이러스학 단위) 감사합니다 HCVcc 리포터 작 제물에 대한 감염증의 JFH1 일본) 및 B. 웹스터 WC 및 그린 (바이러스학 글래드스턴 연구소 면역학). 이 작업은 DFG 자금 지원 하였다 (HE 6889 / 2-1 (EH), 337 / 15-1 2,013 INST 및 이달 337 / 16-1 2,013 (HS)). 하인리히 Pette 연구소, 실험 바이러스학에 대한 라이프니츠 연구소는 자유와 한자 동맹의 도시인 함부르크와 건강의 연방 교육부에 의해 지원됩니다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

Materials

SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM Thermo Fisher 89983 
13C6 L-Arginine-HCl 50 mg Thermo Fisher 88210 
Roti-Load 1 Roth GmbH K929.1
Roti-Blue 5x-Concentrate Roth GmbH A152.2 
10x SDS-Tris-Glycine – Buffer  Geyer Th. GmbH & Co.KG  A1415,0250 
GlutaMAX (100x) Life Technologies GmbH  350500038 
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P4333-100ml 
PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich Chemie GmbH  D8537 
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich Chemie GmbH  T3924-100ML 
Sodium Chloride BioChemica AppliChem GmbH A1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbH A1086,5000A 
EDTA BioChemica AppliChem GmbH A1103,0250
Protease Inhibitor Cocktail 5ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemica AppliChem GmbH A3935,1000
Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF AppliChem GmbH A0625
DC Protein Assay  Bio-Rad Laboratoris GmbH  500-0116 
Glycerol AppliChem GmbH 151339
SDS Ultrapure AppliChem GmbH A1112
Bromophenol blue AppliChem GmbH A2331
β-Mercaptoethanol  AppliChem GmbH A4338
Blasticidin Invivogen ant-bl-1 
Potassium Chloride  AppliChem GmbH A1039
Phenylmethanesulfonyl Fluoride  AppliChem GmbH A0999
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Chemie GmbH  221309
Dipotassium Hydrogenphosphate Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P3786 
DTT  AppliChem GmbH A2948
NP-40 AppliChem A1694
TWEEN 20 AppliChem A4974
Nonfat dried milk powder AppliChem A0830
Anti-ADFP/ ADRP  abcam ab52355
M6PRB1/TIP47 100µg  abcam ab47639
Calreticulin, pAb 200 µg Enzo Life Science GmbH  ADI-SPA-600-F 
Anti-ß-Tubulin  Sigma-Aldrich Chemie GmbH  T6074 200µl  
Ethanol absolute Geyer Th. GmbH & Co.KG  A3678,0250  
Anti-MnSOD Enzo Life Science GmbH  ADI-SOD-110-F
Anti-mouse HRP Thermo Fisher Pierce 32430
Anti-rabbit HRP Thermo Fisher  Pierce 32460
Amersham Hyperfilm ECL GE Healthcare 28906836
Lumi-Light Western Blotting Substrate Sigma-Aldrich Chemie GmbH  12015196001
96 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH  655 180 
Terumo Syringe 1 ml Terumo SS-01T
Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm  SARSTEDT  83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel Bio-Rad Laboratoris GmbH  456-9034 
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH  657160 
Dishes Nunclon 150/20  Fisher Scientific GmbH  10098720 – 168381 
Cell Scraper neoLab Migge GmbH  C-8120 
Tube, 50 ml Greiner Bio-One GmbH  227261 
SafeSeal Tube RNase-free  SARSTEDT  72.706.400 
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm Beckman Coulter GmbH  344062 
Suction Needles Transcodent 6482
Biosphere Fil. Tip 1000  SARSTEDT  70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200 SARSTEDT  70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10 SARSTEDT  70.1130.210 
Dounce Tissue Grinder Fisher Scientific GmbH  11883722
Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders Fisher Scientific GmbH  10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml Eppendorf 5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,  BioRad 165-8033
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber BioRad 165-4110
PowerPac HC Power Supply Biorad 164-5052
Centrifuge  Eppendorf 5424R
Centrifuge  Eppendorf 5424
Optima L-90K Beckman Coulter GmbH  365670
SW 60 Ti Rotor Beckman Coulter GmbH  335649
Infinite M1000 PRO Tecan

Referencias

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Rösch, K., Kwiatkowski, M., Schlüter, H., Herker, E. Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e55585, doi:10.3791/55585 (2017).

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