Summary

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Published: April 17, 2017
doi:

Summary

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

Abstract

טיפות ליפידים חיוניות שכפול של מגוון פתוגנים שונים, ובעיקר את וירוס הפטיטיס C (HCV), כאתר המשוער של morphogenesis virion. ניתן להשתמש בניתוח proteome אגל שומנים כמותיות לזהות חלבוני לוקליזציה או נעקרו מן טיפות שומנים בתנאים כגון זיהומי וירוס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוצל בהצלחה כדי לאפיין את שינויי proteome שומני האגל הבאים זיהום עם HCV. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) ובכך תווית proteome השלם של אוכלוסייה אחת של תאים עם חומצות אמינו "כבדות" לכמת את החלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה. עבור בידוד אגל שומנים, שתי אוכלוסיות התאים (כלומר נגוע HCV / "אור" חומצות אמינו ו / שליטה נגועה "כבדות" חומצות אמינו) מעורבבים 1: 1 ו lysed מכאנית במאגר hypotonic. לאחר הסרת הגרעינים ואת התא דebris ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, חלבוני אגל-מזוהה שומנים מועשרים על ידי שני צעדי ultracentrifugation עוקבים אחריו שלושה צעדי כביסה במאגר איזוטוני. טוהר שברי אגל השומנים מנותח על ידי מערבי סופג עם נוגדנים להכיר תאי subcellular שונים. חלבונים שומנים הקשורים אגל מופרדים ולאחר מכן על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) ואחריו Coomassie מכתים. לאחר tryptic Digest, פפטידים הם לכמת ידי ספקטרומטריית מסה טנדם-יינון נוזלי electrospray-כרומטוגרפיה (LC-ESI-MS / MS). באמצעות שיטה זו, זיהינו חלבוני גייס עד טיפות שומנים על זיהום HCV שעשוי לייצג גורמים המארח בעד או אנטי. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של תאים שונים ותנאי תרבות, כגון זיהום עם פתוגנים, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

Introduction

טיפות ליפידים הם מאוד ציטופלסמית דינמיים (ו גרעיניים) אברונים בתא מורכבים ליבה של ליפידים ניטראלי (טריגליצרידים (TG) ואסתר כולסטרול (CE)) מוקפים בשכבה של פוספוליפידים עם חלבונים מוטבעים 1. כל סוגי התאים לייצר טיפות שומנים, אבל הם משתנים בגודלם, רכב שומנים, ודקורצית חלבון. טיפות ליפידים למלא פונקציות מגוונות, כולל לשמש מאגרי אנרגיה מבשר קרום או פיקדונות חלבון. בנוסף, באמצעות ספיגת שומנים, הם להגן על תאים מפני lipotoxicity, שומני שחרור כמו מולקולות איתות, ומעורבי פירוק חלבונים ו reticulum endoplasmic תגובות דחק (ER) 2. ככזה, שורה של חלבונים הנקשרים טיפות השומנים והם חלים הדור שלהם, השפלה, סחר, ואינטראקציה עם אברונים אחרים. ביניהם יש את המשפחה perilipin של חלבונים מחייב אגל השומנים בתום לב (PLIN1-5)f "> 3.

Biogenesis אגל ליפידים מתחיל הנראה על ER, שבו אנזימים תושב ER לזרז את הסינתזה של ליפידים נייטרלי שמצטברים בתוך bilayer קרום, להרכיב עדשה של ליפידים נייטרלי, תהליך אשר דמיינו לאחרונה יפה שמרים 4. ממברנה כיפוף ורמות phosphatidic חומצה diacylglycerol גבוהות נחשבים אז כדי למשוך חלבונים המעורבים ביוסינתזה פוספוליפידים, כמו סינתזה סימולטני של ליפידים נייטרלי הליבה ואת פוספוליפידים מיגון נדרשת אגל השומנים דור 5. אנזימים מחסה תחומי transmembrane השוכנים בבית ER לזרז את התהליך הזה. הרחבת טיפות שומנים גדולות מחייב הפעילות של מח' אחרת של אנזימים לסינתזה של שומנים כי נמל Helix amphipathic ובכך יכול לנסוע מ ER כדי טיפות שומנים. ניוד השומנים מן טיפות שומנים מתרחש דרך ההפעלה המקומית של triglyceridlipases דואר ו diacylglycerol lipase טריגליצרידים שומני (ATGL) ואת ההורמון רגיש lipase (HSL) או על ידי מסלולי autophagic שונים, כגון מקרו microlipophagy או מלווים בתיווך autophagy 6. טיפות ליפידים אינטראקציה עם אברונים תאיים אחרים, כגון המיטוכונדריה (עבור חמצון בטא וסינתזה השומנים) ו ER (עבור סינתזה השומנים וסחר חלבון), אלא גם עם lysosomes, endosomes, ואת וקואולות המושרה על ידי חיידקים תאיים 7. ואכן חיידקים, וירוסים, טפילים ואפילו למקד טיפות שומנים עבור שכפול והתמדה, ביניהם 8 HCV.

זיהום HCV הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה הקשורות בכבד ברחבי העולם, המהווים כ -0.5 מיליון מקרי מוות בשנה 9. המספר האמיתי של זיהומים HCV אינו ידוע, אך לפי הערכות שבוצעו לאחרונה ש -130 – -150 מיליון בני אדם נדבקים כרוני. אין vaccinדואר קיים, אך הנגיפים ישיר למשחק שאושר לאחרונה להגדיל באופן דראמטי את התגובות טיפוליות לעומת הטיפול הסטנדרטי מבוסס-אינטרפרון. עם זאת, ברחבי העולם, לטיפול בחולים יוגבל הנראה בשל עלויות גבוהות מאוד של תרופות חדשות. כמחצית מכלל אנשים נגועים כרוני עם HCV לפתח מחלת כבד שומני (steatosis), מצב המאופיין על ידי הצטברות יתר של טיפות השומנים ב hepatocytes. מעניין לציין, טיפות שומנים התגלו גם אברונים הסלולר חיוניים כמו שכפול HCV, putatively המשרתים כאתרי הרכבת ויראלי 10, 11.

בתאים נגועים HCV, ליבת החלבון הנגיפית לבין NS5A למקם את טיפות שומנים בתהליך זה תלוי ביוסינתזה טריגליצרידים, כמו מעכבים של diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1) לפגוע בסחר טיפות שומנים וייצור חלקיקי HCV עוקבת 12 </sup>, 13, 14, 15. בנוסף, מוטציות תחומי השומנים מחייבים אגל באחת ליבה או NS5A לדכא HCV הרכבה 16, 17. Core ו NS5A אז לגייס את כל החלבונים הנגיפיים אחרים, כמו גם מתחמי שכפול נגיפי RNA, ממברנות קשורים קשר הדוק עם השומנים טיפות 16. פעולה מתואמת של כל החלבונים הנגיפיים נדרשת לייצור המוצלח של צאצאים ויראלית מדבקים 10, 11. החלבונים המבניים הם חלק virions, ואת החלבונים nonstructural לקדם אינטראקציות חלבון-חלבון הדרוש לתהליך הזה. מעניין לגלות חלבון שומנים בתום לב מחייב אגל PLIN3 / TIP47 נדרשת הן שכפול RNA HCV ושחרור virions 18, 19 <sup>, 20. למרות ההתקדמות שחלה באחרונה אלה, הפרטים מכניסטית, במיוחד של אינטראקציות המארח וירוס בשלבים המאוחרים של שכפול HCV, להישאר מעורפלים, ואת תפקידו המדויק של טיפות השומנים אינה ידועה.

כאן, אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים. באמצעות שיטה זו, מצאנו שינויים עמוקים proteome אגל השומנים במהלך זיהום HCV ו- A3 Annexin מזוהה חלבון המארח כי שיתוף fractionates עם טיפות השומנים ואת נדרשת הבשלה HCV יעיל 21.

Protocol

1. הכנת מדיה עבור תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) הערה: הנה, החלבון SILAC קיט כימות – DMEM בתוספת 50 מ"ג של 13 C 6 L- ארגינין-HCl שימש תיוג SILAC. סרום העובר עגל dialyzed (FCS) מסופק עם קיט כימות חלבון SILAC. <ol style=";text-align:right;d…

Representative Results

טיפות ליפידים חיוניות זיהום HCV כמו באתרים המשוערים של הרכבת virion, אבל המנגנונים המולקולריים של morphogenesis ואת פתח יציאה של virions אינם ידועים ברובם. כדי לזהות גורמי מארח תלות רומן מעורבים בתהליך זה, בצענו ניתוח proteome אגל שומנים כמותי של תאים נגועים HCV <sup class="…

Discussion

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד טיפות שומנים לניתוח proteome אגל שומנים כמותית להשוות את ההעשרה ודלדול של חלבונים הקשורים טיפות שומנים בתנאי תרבות מגוונות, כגון זיהומים ויראליים. כשיטה חלופית, ניתוח proteome יכול להתבצע עם quantifications ללא תווית מבוססת על עוצמות שיא כוללות. שיטה …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ר Bartenschlager (אוניברסיטת היידלברג) עבור המבנים JC1, CM רייס (אוניברסיטת רוקפלר) עבור התאים Huh7.5, ג'יי McLauchlan (המועצה למחקר רפואי יחידת וירולוגיה) עבור לבנות JFH1, ט Wakita (National Institute of מחלות זיהומיות, יפן) עבור JFH1, ו- B וובסטר בב"ש גרין (גלדסטון המכון לווירולוגיה ואימונולוגיה) עבור מבני כתב HCVcc. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, ו INST 337 / 16-1 2013 (HS)). היינריך Pette המכון, מכון לייבניץ עבור וירולוגיה ניסיון נתמך על ידי חינם ו הנזה בעיר המבורג והמשרד הפדרלי בריאות. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או הכנת כתב היד.

Materials

SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM Thermo Fisher 89983 
13C6 L-Arginine-HCl 50 mg Thermo Fisher 88210 
Roti-Load 1 Roth GmbH K929.1
Roti-Blue 5x-Concentrate Roth GmbH A152.2 
10x SDS-Tris-Glycine – Buffer  Geyer Th. GmbH & Co.KG  A1415,0250 
GlutaMAX (100x) Life Technologies GmbH  350500038 
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P4333-100ml 
PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich Chemie GmbH  D8537 
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich Chemie GmbH  T3924-100ML 
Sodium Chloride BioChemica AppliChem GmbH A1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbH A1086,5000A 
EDTA BioChemica AppliChem GmbH A1103,0250
Protease Inhibitor Cocktail 5ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemica AppliChem GmbH A3935,1000
Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF AppliChem GmbH A0625
DC Protein Assay  Bio-Rad Laboratoris GmbH  500-0116 
Glycerol AppliChem GmbH 151339
SDS Ultrapure AppliChem GmbH A1112
Bromophenol blue AppliChem GmbH A2331
β-Mercaptoethanol  AppliChem GmbH A4338
Blasticidin Invivogen ant-bl-1 
Potassium Chloride  AppliChem GmbH A1039
Phenylmethanesulfonyl Fluoride  AppliChem GmbH A0999
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Chemie GmbH  221309
Dipotassium Hydrogenphosphate Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P3786 
DTT  AppliChem GmbH A2948
NP-40 AppliChem A1694
TWEEN 20 AppliChem A4974
Nonfat dried milk powder AppliChem A0830
Anti-ADFP/ ADRP  abcam ab52355
M6PRB1/TIP47 100µg  abcam ab47639
Calreticulin, pAb 200 µg Enzo Life Science GmbH  ADI-SPA-600-F 
Anti-ß-Tubulin  Sigma-Aldrich Chemie GmbH  T6074 200µl  
Ethanol absolute Geyer Th. GmbH & Co.KG  A3678,0250  
Anti-MnSOD Enzo Life Science GmbH  ADI-SOD-110-F
Anti-mouse HRP Thermo Fisher Pierce 32430
Anti-rabbit HRP Thermo Fisher  Pierce 32460
Amersham Hyperfilm ECL GE Healthcare 28906836
Lumi-Light Western Blotting Substrate Sigma-Aldrich Chemie GmbH  12015196001
96 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH  655 180 
Terumo Syringe 1 ml Terumo SS-01T
Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm  SARSTEDT  83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel Bio-Rad Laboratoris GmbH  456-9034 
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH  657160 
Dishes Nunclon 150/20  Fisher Scientific GmbH  10098720 – 168381 
Cell Scraper neoLab Migge GmbH  C-8120 
Tube, 50 ml Greiner Bio-One GmbH  227261 
SafeSeal Tube RNase-free  SARSTEDT  72.706.400 
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm Beckman Coulter GmbH  344062 
Suction Needles Transcodent 6482
Biosphere Fil. Tip 1000  SARSTEDT  70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200 SARSTEDT  70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10 SARSTEDT  70.1130.210 
Dounce Tissue Grinder Fisher Scientific GmbH  11883722
Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders Fisher Scientific GmbH  10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml Eppendorf 5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,  BioRad 165-8033
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber BioRad 165-4110
PowerPac HC Power Supply Biorad 164-5052
Centrifuge  Eppendorf 5424R
Centrifuge  Eppendorf 5424
Optima L-90K Beckman Coulter GmbH  365670
SW 60 Ti Rotor Beckman Coulter GmbH  335649
Infinite M1000 PRO Tecan

Referencias

  1. Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  4. Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
  5. Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
  6. Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
  7. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
  8. Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
  9. Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide – filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
  10. Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
  11. Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
  12. Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
  13. Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
  14. Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
  15. Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
  16. Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
  17. Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
  18. Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
  19. Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
  20. Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
  21. Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
  22. Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
  23. Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
  24. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  25. Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
  26. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
  27. Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3′ untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
  28. Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
  29. Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3’UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).

Play Video

Citar este artículo
Rösch, K., Kwiatkowski, M., Schlüter, H., Herker, E. Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e55585, doi:10.3791/55585 (2017).

View Video